透明细胞肾细胞癌的表观遗传学研究进展*

高永胜， 闫少春， 贾小娥△， 邵 国△

(1包头医学院生物医学研究中心， 基础医学与法医学院， 神经科学研究所， 内蒙古 包头 014060； 2包头医学院第二附属医院， 内蒙古 包头 014030； 3内蒙古低氧转化医学重点实验室， 内蒙古 包头 014060； 4低氧适应转化医学北京市重点实验室， 首都医科大学宣武医院， 北京 100053)

肾脏肿瘤的发病率在人类泌尿系统肿瘤中排名第3，约占恶性肿瘤的3%，发病年龄主要在50～70岁，每年导致90 000多例患者死亡，且呈递增趋势[1]。肾癌的具体发病机制不详，除遗传因素外，吸烟、肥胖、污染和辐射等也是重要因素。大多数透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)患者在早期无任何症状，20%～30%患者在诊断时已发展或转移[2]，故预后较差；患者出现诸如血尿和腰痛等典型症状时，已失去最佳的治疗机会。目前，ccRCC发生机理和机制尚未完全清楚。近年来对ccRCC病因及发病机制的深入研究发现，许多表观遗传学的改变，尤其是DNA甲基化(DNA methylation)异常、组蛋白修饰及非编码RNA调节可能是ccRCC发生发展的重要分子机制，主要涉及DNA、蛋白质和RNA等水平调控基因的表达。这些都为ccRCC的病因研究及诊断、治疗和预后提供了新的理念与途径。

1 ccRCC中的异常DNA甲基化

DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA me-thyltransferases， DNMTs)作用下，S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供体到胞嘧啶的碳5位置形成共价键。大多数胞嘧啶甲基化发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cytosine-phosphoric acid-guanine，CpG)二核苷酸序列中，但也有研究称其可能发生在含有腺嘧啶和胸腺嘧啶的二核苷酸序列[3]。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，需通过重新合成DNMTs来完成，磷酸化是DNA从头甲基化功能的调控模式[4]。DNA甲基化异常与身体各器官部位癌症发生率具有高度一致性。肿瘤抑制基因启动子由于高甲基化而转录失活，最终导致基因表达沉默。有研究显示，异常DNA甲基化是ccRCC发病机制之一[5]。有15%的ccRCC患者肿瘤抑制基因Von Hippel-Lindau(VHL)启动子由于甲基化而失活[6]。DNA低甲基化是指如卫星DNA等DNA重复序列的甲基化程度降低而使染色体稳定性降低，从而导致染色体重排，或导致转录激活和增加癌基因表达。非CpG岛基因座在基因调控中也非常重要。此外，较新的高分辨率测定显示，基因体甲基化可能在基因调控中比启动子甲基化更为重要[7]。

2 ccRCC中抑癌基因的DNA甲基化异常

已有大量研究表明，DNA异常甲基化在ccRCC发生发展中起到重要调控作用，其中，RASSF1A、VHL和p16等抑癌基因表达的下调或沉默可导致周期蛋白的异常累积，最终导致肾癌发生。抑癌基因在细胞的生长发育中起着重要的调节作用，在ccRCC中，抑癌基因的变化较为常见，而肿瘤发生发展的重要因素之一就是抑癌基因启动子区域的甲基化直接抑制了启动子的活性。

2.1抑癌基因RASSF1A2000年，RASSF1A基因从肺癌细胞中被克隆，位于人染色体3p21.3上，编码RASSF1A蛋白，其主要功能是通过参与Rb家族细胞周期检查点诱导细胞周期阻滞，从而促进细胞凋亡和分化来抑制肿瘤发生。研究表明，在肿瘤发生过程中，RASSF1A失活涉及启动子区甲基化和染色体缺失等，RASSF1A的甲基化水平与ccRCC预后相关。通过对179名接受过根治性或部分肾切除术后的日本患者进行研究，使用限制性分析和亚硫酸氢盐测序来评估RASSF1A中5’CpG岛的甲基化水平，结果显示，相比于1级和2级肿瘤，RASSF1A启动子在3级肿瘤中的甲基化水平更高也更频繁；与Ⅱ期患者相比，Ⅲ期患者和Ⅳ期患者甲基化水平也更高；与低甲基化患者相比，高甲基化患者预后显著较差，故高甲基化水平与不良预后相关。这些结果表明，定量分析RASSF1A基因启动子甲基化水平可能是预测ccRCC预后的有效标志物[8]。通过分析RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化水平发现，其高甲基化可引起RASSF1A基因沉默并减少mRNA的表达，表明RASSF1A启动子区的甲基化水平可以间接反映RASSF1A的基因表达水平[9]。RASSF1A基因参与肾细胞癌的发生发展，并作为肾细胞癌早期检测及预后的生物标志物，其mRNA表达水平的测定可作为ccRCC新的预后因子[10]。

2.2抑癌基因VHLVHL基因是重要的肿瘤抑制基因，其失活被认为是肿瘤发生的早期事件。ccRCC的发生和3号染色体短臂3p25上的VHL基因失活密切相关。VHL综合征所伴发的ccRCC(遗传性RCC)均伴有VHL基因的突变，其原因是因为3p25-26染色体缺失[11]。83.4%～90%的散发性ccRCC存在VHL基因的突变，8.3%～15%存在VHL基因启动子甲基化，90%存在3号染色体短臂(3p)缺失，从而造成该基因双等位基因失活[12]。研究发现，稳定的ccRCC细胞与体外寿命小于10代的细胞株相比，包括SLC34A2、SEPP1、sult1c4和VHL等基因表达的差异可能由甲基化和去甲基化引起。另外，有研究表明，VHL基因的功能障碍导致缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)的积累以及ccRCC的血管生成和发病几率的增加[13-14]。因此，VHL基因在ccRCC细胞生长和发育中起关键作用。

2.3抑癌基因p16p16基因位于人第9号染色体短臂(9p21)上，全长8.5 kb，包含3个外显子。p16基因编码的产物为16 kD的蛋白质，是周期蛋白依赖性激酶4抑制因子，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂。p16基因已经在肾癌、肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中发现纯合子缺失以及无义、错义及移码突变，表明该基因以缺失和突变方式广泛参与肿瘤形成。与正常组织相比，肾肿瘤组织中P16蛋白表达低或缺失[15]。

研究表明，ccRCC基因组中130个位点的CpG岛处于甲基化状态，即在肾特异性增强子区域， 异常甲基化特别丰富，这些异常甲基化区域为Ap2a、AHR、HAIRY、ARNT和HIF等转录因子结合位点，可引起ccRCC中缺氧信号通路的失调[16]。此外，除遗传因素外，所有类型的肿瘤中均发现DNA甲基化改变，包括ccRCC[17-18]。肿瘤发生的表观遗传学机制尚不明确。研究表明，在肿瘤发生进展中，表观遗传及遗传变化之间存在因果关系[19]，可是这些变化又彼此独立发生[20]，故了解肿瘤类型中存在的异常表观遗传学变化具有重要的临床前景。核小体占有率已被认为是基因表达的重要表观遗传调节因子[19]。目前，一些新方法可帮助识别DNA甲基化之外的潜在的表观遗传学驱动基因，包括如个性化医学在内的ccRCC治疗策略的新的治疗靶点[21]，这些都为ccRCC诊疗及预后提供了广阔的前景。

3 组蛋白修饰(histone modification)与ccRCC

研究显示，DNA甲基化和组蛋白修饰彼此连接，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)可能与DNMTs共同维持肿瘤抑制基因沉默[22]。

染色质由组蛋白、DNA、非组蛋白及少量RNA构成，其中组蛋白是染色质的基本结构蛋白，其N末端可通过共价键修饰作用发生乙酰化、甲基化及磷酸化等翻译后修饰。乙酰化为最重要的修饰方式，它的完成依赖于HDAC与组蛋白乙酰基转移酶配合。乙酰化与去乙酰化的动态平衡对于基因的正常表达具有积极意义，任何一方失衡均可导致肿瘤发生。通常情况下，乙酰化引起活性转录并与更开放的染色质构象相关，而甲基化的转录效应取决于受影响的残基及甲基化程度。HDACs、组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱甲基酶是调节细胞过程的关键酶，如细胞增殖、血管生成、细胞周期调控及低氧相关作用等。对于这些酶，如果逆转其表观遗传修饰就会具有重新激活肿瘤抑制基因或抑制癌基因潜力，因此可以影响ccRCC的发生发展[23]。上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是涉及肿瘤活动和入侵的关键过程，被认为在ccRCC以及许多其它癌症进展中发挥重要作用。HDACs抑制剂可以抑制转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导的肾近端小管上皮细胞的EMT过程[24]，表明HDACs抑制剂在ccRCC进展期间具有逆转EMT的潜在作用；另外，HDACs抑制剂在某些ccRCC细胞类型的异种移植物中还具有较强的抗肿瘤活性[25]，这些都有待于进一步探索。

4 微小RNA(microRNA)与ccRCC

MicroRNA是由大约22个核苷酸序列组成的非编码RNA。异常microRNA的表达与ccRCC的发生发展和转移有关。

MicroRNA-17-5p、microRNA-224、microRNA-200家族、microRNA106a/b、microRNA-21、microRNA-221、microRNA-199a和microRNA-214均被认为对ccRCC的发生起着重要的作用[23]。MicroRNA-21在ccRCC中过表达，并有助于ccRCC的侵袭和转移[26]。MicroRNA可从受损或凋亡的细胞中释放入血，并且在血浆、血清以及其它体液中含量丰富且稳定，因此有望通过检测外周microRNA作为无创方式检测癌症。近来研究表明，microRNA-210是早期诊断ccRCC的潜在生物标志物[27]。另一项研究发现，肾细胞瘤(renal cell carcinoma，RCC)患者血清中miR-378水平升高，miR-451水平降低，这2个microRNA联合应用可使RCC的鉴定具有81 %的敏感性和83 %的特异性[28]。

目前研究者试图分析microRNA与ccRCC预后之间的关系。有研究表明，microRNA-126的上调与延长RCC患者的生存率密切相关[29]。血浆中高水平microRNA-221的患者存活率明显低于低microRNA-221表达水平的患者，揭示了microRNA可以作为ccRCC的一个独立预后因素。在早期ccRCC及转移性ccRCC患者中发现，microRNA-122在早期ccRCC患者上调、在转移性ccRCC患者下调，microRNA-514在早期ccRCC患者和转移性ccRCC患者均下调，且转移性ccRCC患者下调更明显，这些microRNA的改变与ccRCC复发风险显著相关[30]。

5 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在ccRCC中的变化

DNMTs催化DNA甲基化的发生，该家族至少包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b 4个成员[31]。其中，DNMT1起着维持甲基化的重要作用，DNMT2的功能尚不清楚，DNMT3a和DNMT3b主要参与从头甲基化。DNMTs基因表达上调先于甲基化变化，这在肿瘤的发生发展中尤为突出。据报道，在多种肿瘤细胞中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b高度表达，并与包括膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌和子宫癌等不良预后相关，主要原因可能是由于DNMT1的维持甲基化作用和DNMT3b的从头甲基化作用。为了评估DNMTs在ccRCC中的表达模式及预后价值，Li[32]等共收集RCC患者标本组织97例和无肿瘤组织52例，进行免疫组化分析，结果发现，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白在ccRCC、乳头状RCC和肾嫌色细胞癌组织中的表达均高于无肿瘤组织，且DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达与肿瘤大小、肿瘤病理分期、组织病理学分级和血管浸润相关；Kaplan-Meier生存分析显示，DNMTs蛋白在ccRCC中的表达与所有短期存活和无病存活呈显著相关，多变量分析显示DNMT1的表达是总体生存的独立预后因子，DNMT3a或DNMT3b的表达是患者无病生存的独立预后因素[32]。DNMT3B4表达增加可能与整体甲基化降低及ccRCC的发生有密切关系[33]。DNMTs调控DNA甲基化，故DNMTs在ccRCC整体甲基化中扮演重要角色，可以作为ccRCC患者预后标志物和新的治疗靶标。

6 展望

ccRCC的病因及发病机制非常复杂，表观遗传的改变可调控ccRCC的形成和进展，随着对ccRCC特征性基因组的进一步研究，特别是抑制HDACs和逆转启动子甲基化的ccRCC肿瘤抑制基因的研究以及表观遗传路径改变的进一步研究，使新型微创诊断和预后手段的出现成为可能，ccRCC的诊断诊疗会达到新的水准。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

[2] Rini BI, Rathmell WK, Godley P. Renal cell carcinoma[J]. Curr Opin Oncol， 2008, 20(3):300-306.

[3] Kawakami K, Hirata H, Yamamura S, et al. Functional significance of Wnt inhibitory factor-1 gene in kidney can-cer[J]. Cancer Res, 2009, 69(22):8603-8610.

[4] Deplus R, Blanchon L, Rajavelu A, et al. Requlation of DNA methylation patterns by CK2-mediated phosphorylation of Dnmt3a[J]. Cell Rep, 2014, 8(3):743-753.

[5] Awakura Y, Nakamura E, Ito N, et al. Methylation-associated silencing of SFRP1 in renal cell carcinoma[J]. Oncol Rep, 2008, 20(5):1257-1263.

[6] Dahl E, Wiesmann F, Woenckhaus M, et al. Frequent loss of SFRP1 expression in multiple human solid tumours: association with aberrant promoter methylation in renal cell carcinoma[J]. Oncogene, 2007, 26 (38):5680-5691.

[7] Morris MR, Maher ER. Epigenetics of renal cell carcinoma: the path towards new diagnostics and therapeutics[J]. Genome Med, 2010, 2(9):59.

[8] Kawai Y, Sakano S, Suehiro Y, et al. Methylation level of the RASSF1A promoter is an independent prognostic factor for clear-cell renal cell carcinoma[J]. Annal Oncol, 2010, 21(8):1612-1617.

[9] Akino K, Toyota M, Suzuki H, et al. The Ras effector RASSF2 is a novel tumor suppressor gene in human colorectal cancer[J]. Gastroenterology, 2005, 129(1):156-169.

[10] Klacz J, Wierzbicki PM, Wronska A, et al. Decreased expression of RASSF1A tumor suppressor gene is associa-ted with worse prognosis in clear cell renal cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2016, 48(1):55-66.

[11] Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regular potentially involved in genesis of many tumor types[J]. Science, 1994,264(5157):436-439.

[12] Hakimi AA, Pham CG, Hsieh JJ. A clear picture of renal cell carcinoma[J]. Nat Genet, 2013, 45(8):849-850.

[13] Kim W, Kaelin WG Jr. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer[J]. Curr Opin Genet Dev, 2003, 13(1):55-60.

[14] Linehan WM, Rubin JS, Bottaro DP. VHL loss of function and its impact on oncogenic signaling networks in clear cell renal cell carcinoma[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(4):753-756.

[15] Mena AC, Pulido EG, Guillén-Ponce C. Understanding the molecular-based mechanism of action of the tyrosin kinase inhibitor: sunitinib[J]. Anticancer Drugs, 2010, 21(Suppl 1): S3-S11.

[16] Hu CY, Mohtat D, Yu Y, et al. Kidney cancer is characterized by aberrant methylation of tissue-specific enhancers that are prognostic for overall survival[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(16):4349-4360.

[17] Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma[J]. Nature, 2013, 499 (7456):43-49.

[18] Jones PA. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies, and beyond[J]. Nat Rev Genet, 2012, 13(7): 484-492.

[19] Shen H, Laird PW. Interplay between the cancer genome and epigenome[J]. Cell, 2013, 153 (1):38-55.

[20] Baylin SB, Jones PA. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(10):726-734.

[21] Becket E, Chopra S, Duymich CE, et al. Identification of DNA methylation-independent epigenetic events underlying clear cell renal cell carcinoma[J]. Cancer Res, 2016, 76(7):1954-1964.

[22] Ting AH, Jair KW, Suzuki H, et al. Mammalian DNA methyltransferase 1: inspiration for new directions[J]. Cell Cycle, 2004, 3(8):1024-1026.

[23] Xing T, He H. Epigenomics of clear cell renal cell carcinoma: mechanisms and potential use in molecular pathology[J]. Chin J Cancer Res, 2016, 28(1): 80-91.

[24] Yoshikawa M, Hishikawa K, Marumo T, et al. Inhibition of histone deacetylase activity suppresses epithelial-to-mesenchymal transition induced by TGF-β1 in human renal epithelial cells[J]. J Am Soc Nephrol, 2007, 18(1):58-65.

[25] Verheul HM, Salumbides B, Van Erp K, et al. Combination strategy targeting the hypoxia inducible factor-1α with mammalian target of rapamycin and histone deacetylase inhibitors[J]. Clin Cancer Res,2008, 14(11):3589-3597.

[26] Bera A, Das F, Ghosh-Choudhury N, et al. microRNA-21-induced dissociation of PDCD4 from rictor contributes to Akt-IKKβ-mTORC1 axis to regulate renal cancer cell invasion[J]. Exp Cell Res, 2014, 328(1):99-117.

[27] Iwamoto H, Kanda Y, Sejima T, et al. Serum miR-210 as a potential biomarker of early clear cell renal cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2014, 44(1):53-58.

[28] Redova M, Poprach A, Nekvindova J, et al. Circulating miR-378 and miR-451 in serum are potential biomarkers for renal cell carcinoma[J]. J Transl Med, 2012, 10: 55.

[29] Wotschofsky Z, Busch J, Jung M, et al. Diagnostic and prognostic potential of differentially expressed miRNAs between metastatic and non-metastatic renal cell carcinoma at the time of nephrectomy[J]. Clin Chim Acta, 2013, 416:5-10.

[30] Mercer TR, Dinger ME, Mattick JS. Long non-coding RNAs: insights into functions[J]. Nat Rev Genet, 2009, 10(3):155-159.

[31] 何 苗， 汤为学， 姜 蓉， 等. DNMT在胃癌中的表达及DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 28(7):1262-1268.

[32] Li M, Wang Y, Song Y, et al. Expression profiling and clinicopathological significance of DNA methyltransferase 1, 3A and 3B in sporadic human renal cell carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(11):7597-7609.

[33] Liu Y, Sun L, Fong P, et al.An association between overexpression of DNA methyltransferase 3B4 and clear cell renal cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2017, 8(12):19712-19722.