中国广西涠洲岛海域海绵Callyspongia sp.的化学成分研究

徐宝娟，王世玉，唐生安，王 雪

（1.天津医科大学第二医院药学部，天津 300211；2.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津 300070）

海洋是天然产物的宝库，从海洋中已经发现了许多与陆地植物具有显著结构差异的新颖独特并具有良好生物学活性的化合物。美丽属海绵（Callyspongiasp.）是寻常海绵纲，简骨海绵目，蜂海绵科动物，在中国、日本、印度等国海域均有分布[1]。海绵中有大量的具有抗微生物、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等活性的化学成分[2]。海绵的化学成分主要有脂类[3-4]、生物碱类[5]、肽类[6]、甾醇类[7]、大环内酯类[8-9]、和萜类[10-12]等。本文对美丽属海绵进行了提取、分离和结构鉴定。用硅胶色谱、制备薄层色谱、凝胶色谱和半制备HPLC等方法对各组分进行分离得到单体化合物，采用核磁共振谱(1D、2D NMR)、质谱(ESI-MS)等方法，确定化合物的结构。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及材料 核磁共振仪：Bruker AV 400（TMS内标）；液质联用色谱仪：Alliance 2695,Quattro Micro TM ESI（Waters）；半制备高效液相色谱仪：日本分光公司（JASCO），PU-2089(泵)，RI-2031 和UV-2075（检测器）；制备HPLC色谱柱：YMC-Pack SIL SL12S05-2510WT（10 mm × 250 mm）；氘代试剂（ALDRICH公司）；高速逆流色谱仪（HSCCC）：上海同田TBE1000A；柱色谱和薄层色谱用硅胶均系青岛海洋化工厂生产，所用试剂均系分析纯。

美丽属海绵（Callyspongiasp.）采自于我国广西涠洲岛海域，经天津医科大学药学院唐生安副教授鉴定，标本（WZA-12）保存于天津医科大学药学院。

1.2 提取分离 将Callyspongiasp.甲醇提取物14g，用水和二氯甲烷萃取。将二氯甲烷层提取物用HSCCC 以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶3∶2∶1）为流动相洗脱得到9个组分（0101-0109）。

组分 0105、0106合并通过凝胶渗透色谱（GPC），以甲醇为流动相洗脱得到组分0201-0208。将 0203经制备 HPLC 纯化，甲醇-水（8∶2）为流动相洗脱得到组分0401-0410。将0402经制备HPLC纯化，甲醇-水（6∶4）为流动相洗脱得到化合物8（1.0mg）。

将水层提取物凝胶柱Toyopearl HW-40柱分离，以甲醇为流动相洗脱得到8个组分（2101-2108）。将2104经硅胶柱分离，以二氯甲烷-甲醇（4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1)为流动相梯度洗脱得到 12 个组分（2201-2212）。将2205经制备HPLC纯化，甲醇-水（4∶6）为流动相洗脱得到化合物 2（242.8 mg），化合物1（16.3 mg）。将2210经制备HPLC纯化，甲醇为流动相洗脱得到化合物4（15.6 mg）。将2204经制备HPLC纯化，甲醇-水（6∶4）为流动相洗脱得到化合物5（90.8 mg）。将2206经制备HPLC纯化，甲醇-水（4∶6）为流动相洗脱得到 3 个组分（2501-2503）。将 2501经制备 HPLC 纯化，二氯甲烷-甲醇（2∶1）为流动相洗脱得到化合物3（25.8 mg）。将2105经硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇（2∶1）、甲醇为流动相洗脱得到8个组分（2901-2908）。将2902经制备HPLC纯化，甲醇为流动相洗脱得到化合物6（5.4 mg），化合物 7（6.0 mg）。

2 结果

从海绵中分离得到8个化合物。

2.1 化合物1 牛磺酸，白色无定形粉末。ESI-MSm/z126.02[M+H]+(分子式 C2H7NO3S）。1H NMR（D2O，400 MHz）δ:3.66 （2H,t，J=6.4 Hz），3.85 （2H，t，J=6.4 Hz）；13C-NMR（D2O，100 MHz）δ:37.3,49.2。

2.2 化合物2 乙酰牛磺酸，白色粉末。ESI-MSm/z166.03[M-H]+（分子式C4H9NO4S）。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:1.76（3H，s，-CH3），2.57（2H，t，J=7.4 Hz,-CH2-SO3-），3.27 （2H，m，N-CH2-C），7.79(1H,s,-NH-）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ:22.8（-CH3），35.5（N-CH2-C），50.6（-CH2-SO3-），168.9（C=O）。

2.3 化合物3 N-甲基吡啶-2-羧酸盐，无色针晶。ESI-MSm/z138.07[M+H]+（分子式C7H7NO2）。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:4.30 （3H，s，N-CH3），7.84（1H，t，J=6.0 Hz，5-H），7.90（1H，d，J=7.6 Hz，3-H），8.41（1H，t，J=7.6 Hz，4-H），8.72（1H，d，J=6.0 Hz，6-H）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ:46.0（N-CH3），125.0（C-5），125.5（C-3），144.5（C-6），145.2（C-4），156.2（C-2），161.3（COO-）。

2.4 化合物4 zooanemonin，黄色油状。ESI-MSm/z155.07[M+H]+(分子式 C7H10N2O2)。1H NMR（D2O，400 MHz）δ:3.65 （2H，s，6-H），3.77 （3H，s，9-H），3.87（3H,s,8-H），7.26（2H，s，5-H），8.60（1H，s，2-H）；13C-NMR（D2O,100 MHz）δ:32.4（C-6），33.5（C-9），36.0（C-8），122.0（C-5），132.1（C-4），136.8（C-2），176.0（COO-）。

2.5 化合物5 N-丁基乙酰胺，无色油状。ESI-MSm/z116.10[M+H]+（分子式 C6H15NO）。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ:0.70（3H，t，J=7.4 Hz，-CH3），1.09-1.18（2H，m，-CH2），1.24-1.32 （2H，m，-CH2），1.77（3H，s，-CH3），2.99 （2H，q，J=7.0 Hz，-NCH2），6.94（1H，s，-NH）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ:13.4（C-6），19.8（-CH3），22.7（-CH3），31.3（N-CH2-C），39.1（NCH2-），170.5（C=O）。

2.6 化合物6 尿嘧啶，淡黄色固体。ESI-MSm/z113.03[M+H]+（分子式C4H4N2O2）。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:5.40（1H，d，J=7.5 Hz，=CH-），7.37（1H，d，J=7.5Hz，=CH-），10.76（1H，s，-NH），10.88（1H，s，-NH）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ:100.1（C-1），142.6（C-6），151.0（C-2），163.9（C-4）。

2.7 化合物7 3-甲基尿嘧啶，白色粉末。ESI-MSm/z127.04[M+H]+（分子式C5H6N2O2）。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ:3.39 （3H，s，-CH3），5.41 （1H，d，J=7.6 Hz，=CH-），7.37（1H，d，J=7.5 Hz，=CH-）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ:62.8 （-CH3），100.2 （C-1），142.5（C-6），151.7（C-2），164.5（C-4）。

2.8 化合物8 苯甲酸，无色针晶。ESI-MSm/z121.04[M-H]+（分子式C7H6O2）。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ:7.46（2H，t，J=7.5 Hz，3，5-H），7.60（1H，t，J=7.3 Hz，4-H），8.11 （2H，t，J=7.7 Hz，2，6-H），11.12（1H，br.s，-COOH）；13C-NMR （CDCl3，100 MHz）δ:128.5（C-3），129.4（C-1），130.3（C-2），133.9（C-4），172.8（COOH）。

3 讨论

本文对美丽属海绵进行化学成分分离、纯化并得到单体化合物。通过核磁共振波谱、质谱等方法确定化合物的结构。结果表明，从美丽属海绵分离得到8个化合物，1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道一致，依次鉴定为牛磺酸（1）[13]，乙酰牛磺酸（2）[14]，N-甲基吡啶-2-羧酸盐（3）[13]，zooanemonin（4）[15]，N-丁基乙酰胺（5）[16]，尿嘧啶（6）[17]，3-甲基尿嘧啶（7）[18]，苯甲酸（8）[19]。化合物 1-5和 7-8均为首次从该属海绵中分离得到,当前海绵已经成为海洋药物研究的热点之一，本文丰富了美丽属海绵化学成分的研究，为进一步研究美丽属海绵的药理活性提供基础。例如：牛磺酸作为人体必需氨基酸，在生物体内参与一系列生理过程[20]，如调节渗透压[21]，稳定细胞膜[22]，抗氧化[23]等，本文所得的牛磺酸类物质可以进一步拓展美丽属海绵的药理活性研究，以及有关该类物质构效关系对于其药理作用机制影响的研究。