蛇床子防治骨质疏松的研究概况

广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530200

骨质疏松症是一种系统性的骨骼疾病，可分为原发性、继发性以及特发性三种类型[1]。研究报道骨量和骨丢失是骨质疏松两种关键的决定因素[2]。当骨吸收大于骨形成，造成密骨质丢失、类骨质增多，骨密度下降，就会造成骨质疏松[3]。此外，还存在多种因素易造成骨质疏松：①年龄增加，骨丢失会增大[4]；②性激素分泌下降。激素、雄激素和孕激素等促进骨形成以及抑制骨吸收[5-6]。③细胞因子平衡失调。如促进骨形成的转化生长因子、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)以及护骨素及其配体促进骨吸收的白细胞介素-1(Interleukin-1, lL-1)、白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子TNF失调等[7-8]。④长期服用激素也可能导致骨质疏松[9]。

骨质疏松症与中医理论的“骨痿”病描述接近，《素问》曰：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”[4]。因此，骨质疏松症与肾精关系较为紧密，《医经精义》曰：“骨者，肾之所合也。骨内有髓，骨者，髓所生，肾藏精，精生髓，髓生骨”。又称“髓者，精之所生也，精足则髓足，髓工在骨内，髓足者则骨强”。骨质疏松症的中医证型也与肾关系密切，主要是肝肾阴虚、脾肾阳虚、肾阴虚[10]。由此，中医认为肾虚不足是骨质疏松的主要原因之一。

1 蛇床子的论述

中药蛇床子又称蛇米、蛇粟，是伞形科植物蛇床的干燥果实，味苦辛，性温，入脾、肾二经，具有温肾阳功效[11]。我国大部分地区都产蛇床，河北、江苏、浙江、山东为主产区。与蛇床同科属的品种如兴安蛇床、滨蛇床、碱蛇床等也混淆入药，但是品质不佳[11]。本草典籍记载，蛇床子功效与肾的关系密切，具有补肾的功效。《药性切用》记载蛇床子可“辛苦性温，入肾命而祛风燥湿”；《本草备要》、《本草从新》认为蛇床子“补肾命，去风湿辛苦而温。强阳益阴，补肾祛寒，祛风燥湿”；《本草求真》中论述蛇床子“燥脾湿、燥肾、祛肾风湿热、补肾火”。因此，中医理论认为蛇床子有防治骨质疏松的功效。

2 蛇床子防治骨质疏松研究方法与模型

在动物模型的药理学研究中，蛇床子防治骨质疏松的研究常用三种方法或者模型：①直接给药法[2]；②给予激素致骨质疏松模型[9]；③给予其他药物致骨质疏松模型[3]；④去卵巢骨质疏松模型[12]；⑤护骨素(Osteoprotegerin, OPG)基因敲除骨质疏松模型[6]。直接给药法是指直接给予幼龄小鼠或者大鼠药物(蛇床子提取物以及单体蛇床子素、阳性对照药物)，每天都给予蛇床子素，每个月测一次骨密度，3个月后处死检测骨体积百分率、骨小梁厚度和骨小梁数量，血清骨钙素，抗酒石酸性磷酸酶，钙、磷等含量[2]。糖皮质激素致骨质疏松模型常用地塞米松、醋酸泼尼松造模，将大鼠分成溶媒对照组，模型组，阳性药物组，蛇床子低中高剂量组，除了溶媒对照组，其他组别均给予激素，每周两次给药，每次1 mg/kg，8周后观察各组骨矿化密度，检测Ca2+、P3+、血清碱性磷酸酶、甲状旁腺激素、雌二醇等含量，此法不用对动物模型进行手术。其他药物致骨质疏松模型，例如维甲酸也被用到蛇床子防治骨质疏松的研究动物建模[3]。去卵巢骨质疏松模型与其他类型显著不同在于去卵巢手术。因手术的原因，分组与激素造模略有不同，常分为手术造模组，蛇床子给药组，激素(丹尔雌醇、乙烯雌酚、盐酸雷洛昔芬等)阳性对照组以及假手术组[12]。临床的研究一般直接观察病人服用不同药物的治疗效果来判断是否有效[5,13,14]。OPG基因敲除模型是一种新的模型，OPG是一种肿瘤坏死因子受体，它调节破骨细胞生成，OPG基因敲除后，破骨细胞生成增多，导致骨质疏松[6]。赵永见比较了蛇床子素对这个模型与去卵巢模型的作用[6]，这个模型不用手术，建模效果好，是一种较为理想动物模型。

3 蛇床子对骨质疏松作用

在药理学研究中，无论是动物模型建立过程中或者模型建立后给予蛇床子，蛇床子对骨质疏松都具有防治作用。首先，蛇床子可增加骨长度、骨量以及骨密度[15]，大鼠口服蛇床子素或者蛇床子总黄酮后，骨密度显著增加[2,16]。也有研究报道含蛇床子的健骨灵可提高体现骨密度的两种骨成分——钙、磷的浓度[17]。其次，蛇床子可以改善骨微结构以及骨生物力学，提高抗骨折能力，研究报道蛇床子组的骨体积百分率、骨小梁厚度、骨小梁数量、股骨最大载荷、屈服强度和弹性模量都比对照组高，但骨小梁分离度显著低于对照组[2]。赵永见等也观察到蛇床子素能提高OPG基因敲除小鼠和去卵巢大鼠的骨小梁体积分数，增加两种动物模型的骨小梁数目和骨小梁厚度，降低骨小梁分离度，从而改善骨结构[6]。再次，蛇床子还可抑制骨吸收。蛇床子素降低了抗酒石酸酸性磷酸酶浓度，抗酒石酸酸性磷酸酶浓度是骨吸收生化指标之一，降低了抗酒石酸酸性磷酸酶浓度可抑制骨吸收[18]。有研究报道去卵巢骨质疏松模型动物的血清降钙素、TGF-β1的浓度下降，血清降钙素、TGF-β1可抑制骨吸收，蛇床子可以提高去卵巢骨质疏松模型动物的血清降钙素以及TGF-β1[19]。此外，蛇床子促进骨形成。成魁发现蛇床子素升高骨形成的骨钙素浓度，骨钙素可促进骨形成[2]。蛇床子总香豆素或者蛇床子素有类1,25-(OH)2-D3作用或直接提高1,25-(OH)2-D3水平从而促进成骨细胞合成和分泌骨钙素[9]。碱性磷酸酶是骨形成与骨转换另一重要指标，大鼠去卵巢后，由于形成高转换的骨质疏松，因此碱性磷酸酶比正常组要高，有趣的是蛇床子降低碱性磷酸酶浓度又升高骨钙素浓度，碱性磷酸酶降低提示降低高转换，骨钙素浓度升高则促使骨形成速度大于骨吸收，提高骨密度[20]。蛇床子总香豆素还提高血清IGF-1 浓度促进骨形成。IGF-1是成骨细胞分泌的一种非胶原蛋白，可维持骨矿化速率，罗小玲报道蛇床子总香豆素组的IGF-1达到399.61 μg/L，比骨质疏松模型组203.11 μg/L高不少。对于糖皮质激素引起的动物骨质疏松，蛇床子素降低糖皮质激素引起的炎症介质IL-1分泌增多,来对抗IL-1所致的骨吸收[21]。最后，蛇床子可以刺激雌激素的增加，雌激素选择性的抑制骨吸收，不抑制骨形成，促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞形成。鲍君杰认为蛇床子素可能具有雌激素受体激动剂的作用，研究也发现蛇床子总香豆素或者蛇床子素可提高雌二醇的水平[12]。

4 蛇床子防治骨质疏松的细胞机制

4.1 成骨细胞 在骨微环境中，参与骨重建的细胞主要是成骨细胞(Osteoblast, OB)和破骨细胞(Osteoclast, OC)。OB细胞是骨形成、骨代谢的主要功能单位。OB细胞能够分泌胶原促进钙化，还可调控OC细胞的分化和成熟。蛇床子总香豆素或者蛇床子素对OB的增殖分化，OB分泌的细胞因子、OB相关的基因、酶以及成骨性分化因子等都有调节作用。

蛇床子对OB细胞的增殖与分化具有促进作用。在早期的研究中，张巧艳等给予新生大鼠颅骨原代培养OB细胞蛇床子总香豆素或者蛇床子素，比阴性对照细胞增加达到81.8%，甚至比阳性对照药依普黄酮的效果更好[22]，蛇床子骨靶向药物也观察相似结果[23]。但是，也有研究报道蛇床子素抑制原代成骨细胞的增殖，并且与浓度呈正相关。李玲慧检测了与细胞增殖的活性肽PCNA，以及Wnt信号通路的β-catenin，发现蛇床子素既降低PCNA，又抑制β-catenin的表达[24]。而对成骨样细胞系UMR106的研究，则认为蛇床子醇提物或者蛇床子素促进UMR106的增殖[25]。ALP是OB细胞分化早期的特异性标志之一，蛇床子总香豆素或者蛇床子素能够显著促进OB细胞的ALP[26]，这提示蛇床子促进OB细胞的分化。因此，蛇床子素对于OB细胞增殖的作用还有待继续深入研究。

蛇床子抑制OB细胞分泌的某些细胞因子，这些因子与OC细胞相关的。无论是蛇床子总香豆素还是蛇床子素都能降低OB细胞产生的NO，IL-1和IL-6浓度，抑制IL-6mRNA表达[8]。OB细胞分泌的NO、IL-1和IL-6对OC细胞的形成和分化具有调节作用。IL-1可促使OB细胞产生IL-6，IL-6促进OC细胞的前体细胞生长分化及成熟的OC细胞活化，从而促进骨吸收。因此，蛇床子通过抑制NO、IL-1、和IL-6间接抑制OC细胞成熟，降低了骨吸收。还有研究报道蛇床子素可以促进OB细胞骨OPG的分泌，OPG可以竞争性与核因子NF- κB受体活化因子配体( Receptor Activator of NF- κB ligand, RANKL)结合，并阻碍RANKL与OC细胞及其前体上的NF - κB受体活化因子(Receptor Activator of NF- κB, RANK) 结合。RANKL不能与RANK结合，OC细胞的活化将受到影响[27-28]。其他研究进一步发现，床子素抑制RANKL，增大OPG/RANKL比值，抑制骨吸收的效果进一步加强[23]。

蛇床子促进OB细胞分泌成骨相关的细胞因子。首先，蛇床子可促进或者刺激OB细胞分泌细胞基质I型胶原[29]。其次，明磊国2011报道蛇床子素干预后，OB细胞分泌的骨钙素显著增加，骨钙素能阻止OC细胞的分化，抑制成熟OC细胞的骨吸收活性和诱导OC细胞的凋亡[7]。此外，蛇床子素还上调分化因子COL-1、Runx-2、Osterix以及生长因子bFGF、IGF-I等的mRNA。蛇床子素干预组的COL-1、Runx-2蛋白表达也高于对照组，这些细胞因子都能促进OB细胞的成熟分化[7]。有趣的是当处理了OB细胞的纤毛，蛇床子素促OB细胞分化作用就会减弱[26]。但是它的机制还有待进一步研究。

4.2 破骨细胞 蛇床子抑制OC细胞的成熟与分化，降低OC细胞的活性，诱导OC细胞凋亡，并调节其骨吸收功能。首先，蛇床子总香豆素干预后，培养的OC细胞分化数量下降[30]。其次，秦路平等观察到OC细胞在骨片上形成的吸收骨陷窝的面积可被25 mg/L蛇床子总香豆素减少25.05%，骨片中Ca2+的释放减少41.73%[30]。其他研究也支持这一结果，明磊国等报道，蛇床子素干预效果更好，骨陷窝的数目比对照组少了50%，骨陷窝的面积仅为对照组的45%[18]。此外，25 mg/L的蛇床子总香豆素干预48 h后，OC细胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性降低了26.3%[18]。最后，蛇床子素使OC细胞的凋亡率升高，蛇床子素干预后OC细胞的凋亡率升高14%。蛇床子可能通过以下机制调节OC细胞功能：①调节与OC细胞相关的RANKL/RANK/OPG系统基因，影响RANKL、OPG的表达，抑制OC细胞分化；②下调TRAP基因，抑制OC细胞活性；③抑制OC细胞JNK1/2 的磷酸化水平。

4.3 骨髓基质干细胞 骨髓基质干细胞是OB细胞来源，如果骨髓基质干细胞分化成OB细胞机制出现障碍，会导致OB细胞数量下降或功能降低，因此，它在机体成骨活动中扮演重要角色。研究报道，蛇床子素干预的骨髓基质干细胞碱性磷酸酶显著增高[31]。但是，蛇床子素却不促进骨髓基质干细胞的增殖。此外，蛇床子素促进骨髓基质干细胞释放骨钙素、钙盐沉积量增加。综上，蛇床子素促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化并发挥其作用。

4.4 软骨细胞 软骨参与骨的发育，软骨细胞的退变及矿化可促进骨骼的形成。丁道芳报道高浓度蛇床子素抑制软骨细胞的增殖[32]，蛇床子素可能通过抑制PCNA 和CyclinD1表达发挥抑制软骨细胞增殖。

5 临床应用

临床上，蛇床子多是在方剂中应用于骨质疏松的治疗。张日松报道，含蛇床子的补肾壮骨汤治疗绝经后的骨质疏松要比密盖息要更好，连续服用180 d后，补肾壮骨汤治疗组的骨密度显著增加，雌激素水平增加，碱性磷酸酶下降[14]。另一临床研究报道含蛇床子的骨保合剂不仅增加骨密度降低碱性磷酸酶下降，而且尿中钙/肌酐比也下降[13]。上述研究并不能明确说明蛇床子的机制，仅观察到含蛇床子的方剂效应，因此，蛇床子在临床上的研究还有待进一步深入。

6 蛇床子抗骨质疏松有效成分

蛇床子含有多种成分包括香豆素类、单萜多醇类、糖类、色原酮类、挥发油类，微量元素等。香豆素类成分已经明确有防治骨质疏松的效果，很多研究报道蛇床子总香豆素是有效成分[33]。蛇床子含有多种香豆素，包括：蛇床子素(osthole)，欧芹属素乙(imperatorin)，异虎耳草素(isopimpinelline),佛手柑内酯(bergapten)，花椒毒素(xanthotoxin)，花椒毒酚(xanthotoxol)，蛇床定(cnidiadin)，当归素(archangelich),白芷素(angelicin)，二氢山芹醇乙酸酯(O-acetyl-columbianetin)，哥伦比亚苷元(columbianetin)，欧山芹素(oroselone)，以及auraptenol，columbianadin，isogosferol和demethyl-auraptenol等[33]，目前研究报道只有蛇床子素等成分具有防治骨质疏松的效用，未来，其他的香豆素防治效用的研究可能是蛇床子防治骨质疏松的研究之一。此外，徐宏等研究报道蛇床子总黄酮可提高大鼠骨密度以及股骨力学指标[16]。段旭红则指出色原酮cnidimoside A、5-O-甲基维斯阿米醇、升麻素、5-羟基色原酮-7-O-β-葡萄糖苷等对类成骨细胞UMR106 的增殖有30%的促进作用，这提示这几种可能具有防治骨质疏松的作用[34]。综上，蛇床子防治骨质疏松的有效成分研究还不够明确，仍需进一步深入探讨。

7 小结

蛇床子是一味温肾阳，防治骨质疏松的中药。它可以增强骨密度，通过对OB细胞、OC细胞，干细胞等作用，调节骨质疏松。目前，对于中药治疗骨质疏松的动物模型已经稳定成熟，也可以观察很好的指标与效果。在细胞水平，研究在一定程度上观察到了对骨细胞的作用。但是蛇床子还有哪些成分参与抗骨质疏松作用，蛇床子素具体与骨细胞膜上或者细胞内哪些蛋白或者分子相互作用而引起相应的反应，这些都是蛇床子抗骨质疏松未来的研究方向。