麝香保心丸通过调节apelin/APJ信号转导通路减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤后心功能异常的实验研究

，， ，，

急性心肌梗死(AMI)是临床工作中的常见病、危重病，严重影响人们的身体健康。虽然近年来药物及冠脉介入治疗的进展明显提高了AMI的生存率，但是AMI发病后由于心肌损伤导致的心力衰竭仍严重影响病人的预后及生活质量。因此研究保护心肌损伤后心功能的药物及探索相关机制仍是一项重要的研究课题。麝香保心丸是心内科临床常用的中成药，其在心血管疾病中的疗效逐渐被广大医生及病人所认可。麝香保心丸主要由人工麝香、苏合香、人工牛黄、人参提取物、肉桂、蟾酥、冰片等多种名贵中药材组成[1]。有研究发现，麝香保心丸具有扩张冠状动脉，减慢心室率，改善冠状动脉血流量，降低心肌耗氧量[2]，促进心肌缺血部位血管再生[3-4]，减轻心肌纤维化[5]，减少氯吡格雷抵抗[6]等作用。另有学者报道麝香保心丸具有益气强心，芳香温通等功效，可明显改善心功能不全[7]，但是具体相关机制目前仍不明确，因此，本研究旨在观察麝香保心丸对大鼠急性心肌损伤后心功能不全的影响，并探讨相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及实验动物 麝香保心丸，上海和黄药业有限公司，产品批号100312，规格 22.5 mg，每只大鼠用量为 50 mg/(kg·d)，为预实验中效果最佳剂量。健康SPF级雄性Wistar大鼠由中国医科大学大学动物实验中心提供，apelin ELISA 试剂盒购自中美科技公司；BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒及化学发光检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；硝酸纤维素膜购自美国 Bio-Rad 公司；所有一抗及二抗均购于Abcam公司。

1.2 主要仪器 HX-100E小动物呼吸机(芜湖市一帆医疗器械商行)；BL-420S 生物机能实验系统(合肥远明科技有限公司)；BESN-Ⅱ多通道动物无创测压仪(南京德赛生物公司)；Model 680 型酶标仪(美国 BIO-RAD 公司)；TGL16M 高速冷冻离心机(合肥远明科技有限公司)；UV-3200PCS 紫外-可见分光光度计(合肥市科隆商贸有限责任公司)；FA 25 匀浆机(合肥远明科技有限公司)；Medlab 生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司)；全自动生化分析仪(日本OLYMPUS AU5400)； Bio-Pro 200E 凝胶成像系统(合肥远明科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及给药 健康SPF级雄性Wistar大鼠36只，体重320 g～340 g，采用随机数字法分为3组，每组12只。正常对照组(Control组)：灌胃生理盐水30 d；模型组(I/R组)灌胃生理盐水30 d后制备心肌缺血/再灌注模型；麝香保心丸组 (SXBXW组)：将麝香保心丸溶于生理盐水中，连续灌30 d，后制备心肌缺血/再灌注模型。

1.3.2 动物模型制备 将大鼠用20%乌拉坦(0.5 mL/100 g) 腹腔注射麻醉，仰卧位固定于恒温动物解剖台上，连续监测Ⅱ导联心电图以检测心脏情况。按照文献进行实验手术操作[8]。颈正中切口行气管插管，连接动物呼吸机(呼吸频率70次/min～80次/min，潮气量 40 mL/min，吸呼比维持在1∶3)进行人工呼吸。胸部正中切口，撑开左侧第4 肋间，剪开心包，暴露心脏，于左冠状动脉前降支起始部下2 mm处穿一缝合线，以Ⅱ导联心电图J点弓背抬高，T波异常为成功结扎。关闭胸腔，30 min后重新打开胸腔，用剪刀将结扎线剪开，关闭胸腔，缝合皮肤(24 h后取组织标本)。

1.3.3 尾动脉血压监测 于最后一次用药24 h后用标准尾部测压法测量尾动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)。每只大鼠间隔1 min测量5次，取5次测量的平均值作为大鼠尾动脉收缩压、舒张压，并计算出平均动脉压(MBP)。

1.3.4 血流动力学检测 测量血压完毕后充分麻醉分离出右颈总动脉，将PE50聚乙烯动脉导管经右颈总动脉插入至左心室，固定后用生理记录仪记录左室收缩压(LVSP)、 左室舒张末压(LVEDP)、左室内压上升最大速率(+dp/dtmax)及下降最大速率(-dp/dtmax)。

1.3.5 样本采集 血流动力学检测完毕后，颈动脉取血A、B两管，每管2 mL～3 mL，其中A管含1% 肝素钠溶液0.1 mL，离心(1 000 r/min，10 min)，分离血浆；B管待血液凝固后，离心(2 000 r/min，20 min)，分离血清。分别将收集的血浆和血清于-20 ℃ 冻存。取血后立即处死大鼠取出心脏，沿冠状沟走行分离左心室心肌，每组取4个标本置于10%中性甲醛中固定 24 h，石蜡包埋有待行HE染色，其余部分立即保存于-80 ℃液氮中用于进一步测定。另取心室组织 1份与PBS混合，制备10%组织匀浆，离心，取上清液于-20 ℃ 冻存。

1.3.6 生化指标检测 用自动生化分析仪检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脱氢酶(LDH)的含量。

1.3.7 HE染色 将固定好的心肌组织常规石蜡包埋，Leica石蜡切片机连续切片，厚度约5 μm，HE程序染色，Olympus显微镜观察病理改变。

1.3.8 血浆及心肌apelin含量测定 采用酶联免疫吸附法测定大鼠血浆和心肌组织apelin 含量。

1.3.9 Western blot法测定apelin和APJ蛋白的表达水平 取出冻存组织，在裂解缓冲液中裂解，冰浴下匀浆，4 ℃离心(10 000 r/min，10 min )，取上清液，测定蛋白浓度后，制成蛋白浓度相等的样品，取40 μL蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印至硝酸纤维素膜，3%BSA 封闭 2 h，分别滴加兔抗鼠apelin (ab125213，dilution，1∶500；Abcam，Cambridge，United Kingdom)，APJ (ab214369，dilution，1∶500；Abcam，Cambridge，United Kingdom)抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜后以相应碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育2 h，碱性磷酸酶显色，于凝胶自动成像分析系统下成像。

2 结 果

2.1 各组体重、心脏重量、心脏指数的比较 各组间体重、心脏重量、心脏指数差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠体重、心重及心脏指数的比较(±s)

2.2 各组大鼠血压、平均动脉压及心率的比较 I/R组大鼠SBP、DBP、MBP较Control组明显降低(P<0.01)，但SXBXW组大鼠SBP、DBP、MBP较Control组明显升高(P<0.05或P<0.01)。各组间HR变化不明显。详见表2。

表2 各组大鼠血压、平均动脉压及心率比较(±s)

2.3 各组大鼠血流动力学变化 I/R组大鼠±dp/dtmax及LVSP较Control组明显下降(P<0.01)，但LVEDP较Control组明显升高(P<0.01)；与I/R组比较，SXBXW组±dp/dtmaxLVSP明显升高，LVEDP显著下降，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表3。

表3 各组大鼠血流动力学变化(±s)

2.4 各组大鼠心肌病理学改变 Control组：心肌细胞形态正常，细胞核居细胞中央，心肌间质未见明显变性、坏死及炎细胞浸润。I/R组：有明显的心肌缺血坏死及炎症细胞浸润，细胞核变形及排列紊乱，心肌间质增宽并部分出现炎细胞浸润。麝香保心丸组：与模型组比较，麝香保心丸组心肌细胞坏死及炎症细胞浸润减轻，坏死灶面积减小，细胞核变形及排列紊乱现象减轻。详见图1。

图1各组心肌病理改变(HE染色×400)

2.5 各组大鼠血清心肌酶的变化 I/R组CK-MB及LDH明显高于Control 组(P<0.01)。麝香保心丸预处理后，血清LDH及CK-MB下降(P<0.01)，提示麝香保心丸对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用。详见图2。

注：与Control组比较，##P<0.01；与I/R组比较，**P<0.01。
图2各组大鼠LDH及CK-MB的变化

2.6 各组大鼠血浆及心肌apelin含量的变化 I/R组血浆及心肌apelin含量低于Control 组(P<0.01)，与I/R组比较，麝香保心丸预处理可使血浆及心肌apelin含量升高(P<0.05或P<0.01)。详见图3。

注：与Control组比较，##P<0.01；与I/R组比较，*P<0.05，**P<0.01。
图3各组大鼠血浆及心肌apelin变化

2.7 各组大鼠心肌apelin及APJ蛋白含量的变化 I/R组心肌apelin及APJ蛋白表达低于Control 组(P<0.01)。SXBXW组血浆及心肌apelin含量较I/R组明显升高(P<0.01)。详见图4。

注：与Control组比较，##P<0.01；与I/R组比较，**P<0.01。
图4各组大鼠心肌apelin及APJ蛋白含量的比较

3 讨 论

由宋代经典名方《太平惠民和剂局方》中的苏合香丸衍生而来的麝香保心丸是临床中常用的中成药，自古以来被广泛应用于冠心病、心功能不全等心血管疾病的治疗。大量基础药理学研究发现，麝香保心丸具有多重药理学作用，例如扩张冠状动脉，改善心肌重构，减慢心室率，降低心肌耗氧量，改善冠脉血管痉挛，保护血管内皮细胞，减轻心肌纤维化，改善缺血心肌局部微循环，促进缺血心肌血管再生。现代临床研究发现麝香保心丸具有改善心功能的作用，但是相关机制研究仍不明了，因此进一步研究麝香保心丸的强心机制仍是一项重要的工作。

在本项研究中，通过检测大鼠无创血压、血流动力学、心肌病理学改变、心肌酶的变化，发现麝香保心丸具有保护大鼠缺血/再灌注心肌损伤，改善心功能的作用。

为了进一步研究麝香保心丸的相关保护机制，又对apelin/APJ信号转导通路进行了研究。apelin 是一种最早从牛胃中分离出来的具有重要作用的原前体肽，它广泛存在于各种组织当中并在心肌及冠状动脉中高度表达，具有明显的扩张血管、降低血压、正性肌力等多种生物学功能。有研究表明apelin是 APJ 的天然配体，二者组成的apelin/APJ系统在心力衰竭发生、发展中具有重要的调节作用[9-10]。有学者发现，在扩张型心肌病及缺血性心脏病病人中，应用apelin后心功能改善不佳，其机制主要由于心室APJ 的表达明显减少，导致apelin的正性肌力作用可能受到限制[11]。另有研究发现当出现心肌损伤时，因血浆和心肌的 apelin水平下降，通过外源性干预 apelin的生成可减缓心力衰竭的发展[12]。据报道apelin表达缺陷的小鼠有明显进展为心衰的趋势，应用apelin干预后可逆转这一过程[8]。因此apelin/APJ信号转导通路是改善机体心功能不全的一个重要作用靶点。本研究通过检测血浆及心肌apelin的含量发现，麝香保心丸可以明显提高大鼠血浆及心肌中apelin的含量。同时Western-blot也发现心肌apelin及APJ的蛋白表达在麝香保心丸预处理组可明显升高，提示麝香保心丸是部分通过调节apeli/APJ信号转导通路来实现改善心功能不全。

本实验表明麝香保心丸可以减轻大鼠心肌的缺血/再灌注损伤，明显提高心功能，这种保护作用可能是部分通过激活apelin/APJ信号转导通路来实现的。此结果将为阐明麝香保心丸的心肌保护作用及临床应用提供更多实验依据及理论依据。

综上所述，麝香保心丸具有保护大鼠心肌缺血/再灌注损伤后心功能异常，这种保护作用部分通过调节apeli/APJ信号转导通路来实现。

[1] Yan SK，Zhang WD，Liu RH，et al.Chemical fingerprinting of Shexiang Baoxin Pill and simultaneous determination of its major constituents by HPLC with evaporative light scattering detection and electrospray mass spectrometric detection [J].Chem Pharm Bull (Tokyo)， 2006，54(7)：1058-1062.

[2] Zhang XZ，Hou YM，Ou ZH.Effect of Shexiang Baoxin pill on coronary vasodilation by analysis of coronary angiography [J].Chin J Integr Trad West Med， 2014，34(12)：1432-1435.

[3] Huang F，Liu Y，Yang X，et al.Shexiang Baoxin pills promotes angiogenesis in myocardial infarction rats via up-regulation of 20-HETE-mediated endothelial progenitor cells mobilization [J].Atherosclerosis， 2017，263：184-191.

[4] Shen W，Fan WH，Shi HM.Effects of Shexiang Baoxin pill on angiogenesis in atherosclerosis plaque and ischemic myocardium[J].Chin J Integr Trad West Med，2010，30(12)：1284-1287.

[5] Wu DJ，Hong HS，Jiang Q.Effect of Shexiang Baoxin pill in alleviating myocardial fibrosis in spontaneous hypertensive rats[J].Chin J Integr Trad West Med， 2005，25(4)：350-353.

[6] Zhang L，Liu N，Zhang J，et al.Effect of Shexiang Baoxin pills on clopidogrel resistance in patients with acute coronary syndrome [J].Pak J Pharm Sci， 2016，29(6 Suppl)：2303-2306.

[7] Li YF，Cao FF，Liu F，et al.Effects of Shexiangbaoxin pills on the expression of cardiac α- and β-adrenergic receptor subtypes in rat hearts with heart failure induced by myocardial infarction [J].Chin Med J(Engl)， 2012，125(9)：1556-1562.

[8] Kuba K，Zhang L，Imai Y，et al.Impaired heart contractility in Apelin gene-deficient mice associated with aging and pressure overload[J].Circ Res，2007，101： e32-e42.

[9] Kleinz MJ，Davenport AP.Immunocytochemical localization of the endogenous vasoactive peptide apelin to human vascular and endocardial endothelial cells [J].Regul Pept，2004，11(8)：119-125.

[10] Yu XH，Tang ZB，Liu LJ，et al.Apelin and its receptor APJ in cardiovascular diseases [J].Clin Chim Acta，2014，428：1-8.

[11] Pitkin SL，Maguire JJ，Kuc RE.Modulation of the Apelin/APJ system in herat failure and atherosclerosis in man [J].Br J Pharmacol，2010，160(7)：1785-1795.

[12] Koguchi W，Kobayashi N，Takeshima H.Cardioprotective effect of Apelin- 13 on cardiac performance and remodeling in end-stage heart failure [J].Circ J，2012，76(1)：137-144.