SFTPC突变致儿童间质性肺病伴家系外显不全3例并文献复习

代 丹 洪 达 时艳艳 王立波 钱莉玲

1 病例资料

3例中男1例，女2例，均足月顺产，出生体重3 100～3 600 g，以咳嗽、气促和发绀为主要表现。表1显示，例1以重症肺炎起病，表现为呼吸衰竭，持续有创机械通气，撤机困难，反复气胸；例2和3临床表现与实验室检查未提示严重感染，CT均为两肺弥漫磨玻璃样改变，控制炎症后仍有气促、咳嗽，在复旦大学附属儿科医院(我院)住院期间持续离氧不耐受。结合3例临床表现和CT，考虑肺表面活性蛋白基因缺陷可能，临床诊断儿童间质性肺疾病(chILD)。例1死亡，例2和3目前尚存活。

取得家长知情同意后，对3例患儿及其家系行全外显子组测序(WES)。EDTA抗凝管采集患儿及父母、同胞全血各2 mL，采用QIAGEN公司mini blood全血试剂盒提取基因组DNA。基因组DNA经过超声打断、末端修复、接头连接和杂交捕获(美国Agilent公司SureSelect Human All Exon试剂盒)。捕获文库采用Illumina HiSeq 2000平台进行序列检测。数据处理和分析参照我院转化中心建立的高通量测序数据分析流程[1]，筛选出符合临床表型的致病变异并行Sanger测序验证。3例患儿的核心家系图谱及突变位点的Sanger测序结果见图1。

表1 3例患儿的临床资料

图13例患儿的核心家系图谱及突变位点的Sanger测序结果

注 箭头示先证者；斜杠示死亡病例；黑色填充示有表型；加号示突变阳性者；问号示未行基因检测

2 文献复习

检索PubMed、Web of Science数据库和中国知网、维普、万方数据库，检索时间均从建库至2017年11月，共检索到SFTPC突变致chILD病例139例(女62例、男46例、31例性别不详)，25例有肺病家族史，表2显示139例chILD的基因型及临床表型特点。其中68例行家系基因检测，发现新发突变34例，有明确遗传来源31例，3例不详。表3显示，结合7篇国外文献报告SFTPC突变致chILD外显不全10例和本文3例的临床资料及基因型特点。

表2 SFTPC突变基因型-临床表型比较(n)

注 1)总报道病例数/含家系测序结果病例数；2)linker区错义突变65例中有5例成人，其中3例成人家系均有家族史；3)BRICHOS区错义突变27例中有6例成人；ILD：间质性肺病；CPI：婴儿慢性间质性肺炎；CIP：慢性间质性肺炎；DIP：脱屑性间质性肺炎；NSIP：非特异性间质性肺炎；UIP：普通型间质性肺炎；PAP：肺泡蛋白沉积症；hPAP：遗传性肺泡蛋白沉积症；BPD：支气管肺发育不良；Hch：羟氯喹；NO：一氧化氮；ECMO：体外膜肺氧合；GGO：磨玻璃样变；PF：肺纤维化；FPF：家族性肺纤维化；IPF：特发性肺纤维化；PS：肺表面活性物质

3 讨论

chILD是一类病因庞杂、异质性极大的呼吸系统障碍性疾病，对325例原因不明的儿童慢性肺疾病研究表明，SFTPC突变约占不明原因chILD或儿童慢性肺病病因的14.4%～17%[2，3]。SFTPC基因突变所致chILD多被认为是常染色体显性遗传(AD)疾病，主要表现为散发的新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)或婴幼儿起病的慢性间质性疾病及家族性成年肺纤维化(FPF)。Thomas等[11]最早在30多人的FPF家系(14例有肺部表型，其中3例儿童)中行基因测序，存活的有肺部表型者均检测到SFTPCexon 5的c.563T>A(p.L188Q)杂合变异，经详尽的体内肺组织和体外细胞实验证实该变异为此家系FPF的致病突变，家系中另有2例无肺部表型者也检测到携带这一突变。随后Cameron等[7]在116例chILD或儿童慢性肺病中检测到7例SFTPCexon 3的c.218T>C(p.I73T)杂合突变患儿，发现其中有2例患儿父母之一也为I73T携带者，但无临床可见的肺部表型，尽管并未进行严格的肺部检查。这些无表型携带者的发现提示，SFTPC突变致病与经典的孟德尔遗传模式不符，但详尽的功能学实验又支持这些突变致病。其实早在20世纪70～90年代大量对FPF的家系研究中就不断有人提出FPF可能是伴有外显率不全的AD遗传病[12～15]，只是由于当时检测技术的限制无法进行基因检测，因此这种假设未能得到证实。随着基因测序技术逐渐被用于遗传病的研究，SFTPC致病突变的无表型携带者在chILD和FPF家系中被陆续发现并报道，才明确了该病的外显不全特性。本文报道的3例SFTPC突变致chILD家系测序中均发现有与先证者携带相同基因突变的无表型携带者，与国外报道情况相似，此前在中国汉族人群中尚无报道。

表3 13例存在家系外显不全的儿童间质性肺病临床资料及其SFTPC基因突变特点

注 例7为纯合突变，其余均为杂合突变；ILD：慢性间质性肺病；CPI：婴儿慢性肺炎；DIP：脱屑性间质性肺炎；PAP：肺泡蛋白质沉积症；NSIP：非特异性间质性肺炎；GGO：磨玻璃样变; PF：肺纤维化

SFTPC位于8p21.3，含6个外显子，前5个外显子编码全长197个氨基酸的SP-C整合膜蛋白前体(ProSP-C)，分子量21 kDa的ProSP-C经过一系列N端和C端的蛋白水解后最终形成3.7 kDa的极疏水性的成熟SP-C蛋白[16]。SP-C是组成肺表面活性物质(PS)的4种表面活性蛋白中含量较为丰富的一种，由肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性合成和加工后与SP-B共同发挥作用，增强PS磷脂的吸附和铺展，从而促进肺泡腔内PS膜的形成，对维持PS降低肺表面张力、避免呼气末肺泡萎陷和加速肺液清除功能具有重要作用[17]。ProSP-C由4个结构域组成：NH2-端(1～23氨基酸残基)、成熟SP-C跨膜区(24～58氨基酸残基)、linker区(59～89氨基酸残基)和BRICHOS区(90～197基酸残基)。不同区域、不同突变类型的致病机制不同，疾病严重程度及临床表现也存在一定差异。linker区和BRICHOS区作为具有β-转角倾向性的极疏水性成熟SP-C跨膜区的分子伴侣，帮助跨膜区正确插入内质网膜并维持正常结构，避免其形成β-转角结构而导致细胞内淀粉样纤维的形成和沉积[18]。BRICHOS区被发现在>30个人类编码基因上存在，如多种退行性疾病、肿瘤及ILD的疾病相关蛋白中均有发现，并在多种物种中具有高度保守性[19]，因此该区突变致病性高。SFTPC突变致chILD的病例报道中，BRICHOS区突变类型最为丰富，包括错义突变、无义突变、剪切突变、缺失和重复，共报道51个不同突变位点，占已报道SFTPC突变位点数的72.9%，其中无义突变、剪切突变和缺失/重复对基因编码产物的影响更为严重，包括翻译的提前终止、移码突变导致的大量氨基酸改变，甚至跳过整个外显子导致该外显子转录和翻译缺失，从而造成SP-C蛋白结构和数量的明显异常，使得肺表面活性物质功能严重障碍，导致明显的临床表型。总结BRICHOS区突变病例的平均起病年龄及年龄跨度(2.7月，0～1岁)均明显早于成熟SP-C区和linker区的突变(11.3月，0～11岁)；BRICHOS区突变的病死率(16.7%)显著高于非BRICHOS区突变(3.1%)，其中BRICHOS区错义突变的病死率又显著低于其他类型突变。BRICHOS区突变临床更多见RDS和呼吸困难，起病时间早，病情重，多需要长时间机械通气，非BRICHOS区更多以慢性咳嗽、气促和营养不良等慢性表现为主，部分可有反复呼吸道感染。

SFTPC突变于2001年由Nogee首次在1例生后6周表现为呼吸窘迫并且家族史阳性的足月儿中发现和报道，本文文献复习的139例SFTPC突变致chILD中，错义突变102例(73.4%)，其中国内外最常见的linker区I73T错义突变59例(42.4%)，高于既往报道的25%～35%[2]，国内SFTPC突变病例报道7例，均为错义突变，其中3例为I73T错义突变(42.9%)，与国外情况相当。139例SFTPC突变致chILD中有家系测序数据的共68例，其中先证者家系成员存在无症状携带者的10例(14.7%)，加上本文3例，13例存在家系外显不全现象的病例中除例10为片段缺失(缺失3号内含子和部分4号外显子)外，其余12例均为错义突变(92.3%)，其中5例I73T错义突变(38.5%)，外显不全病例中错义突变的比例远高于总报道病例数中错义突变所占的比例，提示SFTPC突变外显不全现象可能更常发生于错义突变的病例家系中。不仅因为错义突变病例所占比例更高，还因为相比而言，无义突变、剪切位点突变和缺失重复可能对基因编码产物的影响更大，通常导致的临床表型也更严重，所以出现无症状携带者的可能性较小。尽管有1例为片段缺失，但其主要是内含子序列和少部分外显子初始碱基的缺失，在转录翻译过程中可能对基因编码产物的影响相对较小。以上发现表明，遗传性chILD外显不全机制可能与SFTPC突变类型有关，错义突变可能是外显不全现象的高发类型，但尚无证据提示外显不全是否具有错义突变位点特异性。

存在家系外显不全现象的13例病例中仅4例为BRICHOS区突变(30.8%)，低于总的139例中BRICHOS区突变的比例(60例，43.2%)，可能是由BRICHOS区突变的临床表现通常更重、病死率更高，突变携带者更多在生后第1周起病，常表现为顽固性呼吸衰竭，需要早期机械通气，流产或生后不久死亡的病例可高达1/3[5]。Guillot等[20]报告了18例SFTPC突变致chILD，其中含11例非BRICHOS区错义突变和5例BRICHOS区错义突变，BRICHOS区错义突变病例起病年龄显著早于非BRICHOS区错义突变，且有1例病例死亡，为BRICHOS区错义突变。Turcu等[21]和Akimoto等[6]分别报告的7例和4例SFTPC突变致chILD均有1例死亡病例，为BRICHOS区突变.因此推测BRICHOS区突变出现无表型携带者的可能性相对较低，也提示SFTPC突变致chILD伴外显不全的发生机制还可能与突变所在区域有关，非BRICHOS区突变可能是发生外显不全现象的热点区域，并且非BRICHOS区的每个具体突变位点的致病机制也可能不同，均需要进行严谨的实验研究和验证。

目前对SFTPC突变致chILD伴外显不全发生机制的研究多局限于现象讨论的层面，深入的机制研究很少，因此对其具体发生机制也知之甚少。主要认为存在其他肺相关基因变异的修饰作用影响了SFTPC突变的外显率，如ABCA3基因编码的膜转运蛋白定位于板层小体膜上，对极疏水性SP-B和SP-C介导的磷脂转运至板层小体发挥重要作用，因此ABCA3突变可能影响板层小体的产生，而板层小体是SP-B和SP-C进行最后加工的场所，从而使SP-B和SP-C总量减少，加重疾病严重程度[22]。有研究发现，表面活性物质基因缺陷的患者有ABCA3杂合错义突变时，SP-B和SP-C表达量有更为显著的减少[23]；其次，ABCA3致病突变的主要表型为RDS和chILD，与SP-B和SP-C致病突变的表型谱相似，也支持这一说法。并且由于ABCA3基因大，正常人群中单核苷酸变异(SNV)的发生率较高，因此该基因SNV可能更多时候仅参与疾病发生，而非发挥主导作用。van Moorsel等[24]对有SFTPC突变的5个家族性肺纤维化家系行ABCA3测序，检测到2个家系部分SFTPC突变成员同时携带有ABCA3杂合错义突变，突变的蛋白预测均非有害，但其中1例ABCA3突变携带者的发病年龄比其他患者约早15年，而这些SFTPC突变家系的儿童患者中均未检测到ABCA3突变，提示ABCA3突变对起病年龄及疾病表型具有影响作用，但具体机制尚需进一步研究。NKX2-1编码的转录因子也对多数PS相关基因的表达具有重要作用，包括SP-B、SP-C和ABCA3等，该转录因子质和量的异常可能影响这些基因的正常表达，从而导致肺相关疾病的发生[23]。因此，再次对本文3例患儿WES测序数据进行分析，仅例3筛选到ABCA3的1个杂合错义突变：NM_001089 exon16 c.G1913A(p.R638H)，经Sanger测序验证，携带相同SFTPC突变的患儿父亲和姐姐均未检测到携带此变异，该变异来自母亲，在ExAC数据库有26个杂合携带者，千人基因组计划数据库人群频率0.79‰，尽管并非罕见变异，蛋白预测也非有害，但是由于该基因的正常功能对SP-B和SP-C的加工至关重要，因此ABCA3的这类非罕见变异是否对SFTPC致病突变有协同或修饰作用仍需在SFTPC致病突变的较大样本病例中进一步研究。

除此之外，表观遗传和特定环境因素都可能是SFTPC突变最终表型的影响因素，对SFTPC突变是否表现出可识别的表型、疾病轻重程度、起病时间、病情进展速度等产生影响。目前对可能的环境因素尚无深入的研究，如呼吸道合胞病毒等病原体感染、环境中的有毒生化物，都可能激发SFTPC突变相关性肺病表型的出现，并对其广泛的临床表现度具有重要影响[11]。也有一些外显不全突变病例主要发生在男性或者女性，推测某些突变表型可能存在性别特异性[7]。本文13例患儿中男女性别比相当，未见明显性别差异，但由于样本量小，该病外显不全是否与性别有关还应在同一突变的多个外显不全家系中进行研究。

13例SFTPC突变致家系外显不全的chILD中，有1例复合杂合突变、1例纯合突变和1例携带2个SFTPC变异位点，父母均为无表型携带者，这些病例有悖于以往对SFTPC突变致chILD为AD的认识，也提示SFTPC突变致病机制的复杂性，现已逐渐更新对其致病模式的认识，认为既可以是AD也可以是AR遗传模式。并且由于SFTPC突变的临床表现变异度大，起病年龄从出生至儿童期甚至老年，严重程度也有极大差异，可表现为呼吸窘迫，长期撤机困难，快速进展为终末期肺病最终死亡；也可为轻微咳嗽，进展缓慢的ILD和(或)成年肺纤维化[11,25,26]。因此对SFTPC突变的外显不全与表现度差异大的界定有时很困难，有些突变携带者直到成年期可能仍无临床表现和影像学改变，但病理学可能已有轻微的纤维化改变，这种损害可能进展很缓慢[27]，由于早期病变程度极其轻微，临床常规检查手段难以检测和明确诊断，需要更长时间的随访或更为严格的肺部检查(如肺活检)，13例患儿中有2例起病年龄是11岁，余11例均在2岁内起病，这些病例家系的无表型携带者应该继续追踪随访，以期更好的了解SFTPC突变的外显不全现象。完善的家系测序是近几年才逐渐开展的，因此既往很多病例并未对无症状的先证者家系成员进行基因检测，而仅对有可见表型的直系亲属进行基因检测，还有部分未能获得家系成员血样，因而无法检测突变携带情况。因此，SFTPC突变外显不全家系数量可能远较本文统计的多，对基因型致病的具体机制的探索和理解对寻找基因型对应的的特异治疗方法至关重要。

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