生防菌株洋葱伯克氏菌对草莓果实采后病害控制及安全性评价

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(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所,山西太原 030031)

微生物防治方法由于其无残留、不产生耐药性等优点,被认为是最有可能替代化学杀菌剂的方法之一[1-2]。洋葱伯克氏菌(Burkholderiacepacia)在20世纪50年代作为一种植物病原菌被人们认识,Burkholder首次报道该菌可引起洋葱鳞茎腐烂,称为洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)[3]。洋葱伯克氏菌广泛存在于土壤、水和植物根际。农业领域中,洋葱伯克氏菌具有生物防治、生物降解以及促进植物生长等多种功能,在农业方面有广泛应用前景及生物防范功效[4-6]。

洋葱伯克氏菌是一类基因型不同、表型相近的菌株复合群,目前已发现17个基因型,称为洋葱伯克氏菌复合群(Burkholderiacepaciacomplex,简称Bcc)[7-8]。Bcc能防治多种植物的真菌性病害,如由腐霉(Pythiumspp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)和镰刀菌(Fusariumspp.)引起的植物猝倒病[9];Parke J L[9]等发现洋葱伯克氏菌对梨青霉病(Penicilliumexpansum)、苹果灰霉病(Botrytiscinerea)和桃褐腐(Sclerotinialaxa)以及柑橘各种采后病害也具有生防效果;De Costa等[10]从香蕉表面也分离到伯克氏菌,可有效防治香蕉炭疽病(Colletotrichummusae)的发生。本实验室从杏果实分离得到基因型为Burkholderiacontaminans的洋葱伯克氏菌,初步研究发现[11]该菌株可以降低玫瑰香葡萄采后腐烂率。Bcc复合群中的一些基因型曾作为人体的条件致病菌[12-14],在英国、加拿大等囊性肺纤维化(CF)病人中大流行,引起败血症、肺炎、心内膜炎和伤口感染等[15-16],因此研究该类生防菌株的安全性也十分必要。本文一方面研究洋葱伯克氏菌对草莓果实采后病害的防治效果,另一方面进行动物实验,进一步测定其安全性,旨在为生防菌洋葱伯克氏菌的开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

洋葱伯克氏菌(B.contaminans) 本实验室制备;灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea) 分离于自然发病的草莓果实;草莓果实 采自山西省晋中市东阳镇大棚内,早8点前采收,品种为“红颜”,采摘当天运回实验室预冷并贮藏于0 ℃冷库中;Wistar大鼠(体重180～220 g,动检号:070101)、家兔(体重2.5～3.0 kg)、豚鼠(体重为200～250 g) 山西医科大学实验动物中心提供。

LS-B50L-I型压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司;BSD-WF2200振荡培养箱 上海博讯实业有限公司;HDL型超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司;DHP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 生防菌B-1发酵液的制备 生防菌洋葱伯克氏菌B.contaminansB-1由本实验室分离于杏果实表面,进行分子和生理生化鉴定。将保存于-80 ℃的B-1在PDA固体培养基活化培养后,挑取单菌落于50/250 mL LB液体培养基中28 ℃ 200 r/min摇瓶培养。

1.2.2 孢子悬浮液的制备 由发病果实分离的灰葡萄孢霉于PDA平板26 ℃培养5～7 d后,刮取分生孢子,采用血球计数法用无菌水配制成1.0×105孢子/mL的悬浮液。

1.2.3 草莓果实的预处理 自然腐烂法所用草莓果实为同一成熟度及颜色大小一致的果实,无病虫害及机械损伤。伤口接种法预处理:将同一大小颜色的健康草莓果实置于2%的次氯酸纳溶液中浸泡2 min,无菌风吹干放于灭菌的塑料筐中,用灭菌针在草莓腰部刺直径5 mm深度3 mm的伤口,每个果实刺1个伤口。

1.2.4 不同发酵时间对草莓果实采后病害的抑制 将经过6、12、24、48、72、96 h摇瓶培养的发酵液分别浸泡挑好的无伤口的草莓果实(CK处理不浸泡,阴性对照用无菌水浸泡),浸泡时间为3 min,无菌风吹干外套保鲜膜,于6 ℃下贮藏20 d。重复上述操作,16 ℃下贮藏9 d。每次处理0.5 kg的草莓果实,实验重复3次。

参考李静[17],根据果实腐烂等级,计算果实腐烂指数,用果实腐烂指数代表果实采后病害的程度。果实腐烂程度分5个等级,分级标准为:0级:果实完好,无任何腐烂;1级:果实表面现轻微斑点,腐烂面积小于1/3;2级:果实腐烂面积约果实表面的1/3～1/2;3级:果实腐烂部位超过果面1/2,但尚有一定硬度;4级:果实整体完全溃烂。腐烂指数计算公式如下:

果实腐烂指数(%)=[∑(各级腐烂果个数×腐烂级别)]/(最高腐烂级别×果实总个数)×100

1.2.5 不同处理方式对草莓果实采后病害的抑制 将1.2.1发酵24 h的发酵液置于小型喷雾器中,对放置于筐中挑好的无伤口草莓果实,进行均匀的喷淋实验,喷至表面果实均有液滴覆盖。另取相同的发酵液对草莓果实进行浸泡实验,分别浸泡0.5、1、2、3、4 min(CK不浸泡),喷淋或浸泡后无菌风吹干,外套保鲜袋,放置16 ℃贮藏9 d,参考1.2.4计算草莓果实的腐烂指数。每次处理0.5 kg的草莓果实,实验重复3次。

1.2.6 生防菌不同处理液对草莓采后病害的抑制 将1.2.1发酵24 h的发酵液分别进行如下处理。A:发酵原液;B:稀释5倍发酵液;C:稀释10倍发酵液;D:菌悬液(发酵液离心后,菌株用无菌水稀释至原体积);E:5倍菌悬液(同上,菌体稀释5倍);F:10倍菌悬液(同上,菌体稀释10倍);G:上清液;H:稀释5倍上清液;I:稀释10倍上清液。

将挑好的无伤口的草莓果实置于上述不同处理液中浸泡3 min,CK用无菌蒸馏水浸泡3 min。处理后用无菌风吹干,外套保鲜袋,放置16 ℃下贮藏9 d,参考1.2.4计算果实草莓的腐烂指数。每次处理0.5 kg的草莓果实,实验重复三次。

1.2.7 生防菌不同处理液对草莓采后灰霉病的影响 发酵液A、B、C、D、E的处理同1.2.6的A、B、C、D、G。F:热杀死液(发酵液经过121 ℃下灭菌15 min)。在草莓果实伤口处加不同的生防菌菌处理液40 μL,CK加无菌蒸馏水。无菌风吹2 h后,于每个伤口再加15 μL孢子悬浮液,外套保鲜袋,放置16 ℃下贮藏5 d。每次处理0.5 kg的草莓果实,实验重复3次。

参考赵妍[18]统计果实发病率及病斑直径。果实发病率为被感染的伤口数与伤口总数的百分比表示,病斑直径为用十字交叉法测量病斑最长值和最短值,取其平均值为腐烂部位的直径。

1.2.8 动物实验方法 根据《农药登记毒理学实验方法》[19]的标准,对该生防菌株进行相关实验,包括大鼠急性经口毒性实验、皮肤刺激实验、眼刺激实验和皮肤变态(致敏)实验。动物采用标准饲料喂食,自由饮水的方式。

1.2.8.1 大鼠急性经口毒性实验 将受试大鼠按体重随机分为4组,每组8只,雌雄各半。分别以发酵液1000、2150、4640、5000 mg/kg的剂量进行一次经口灌胃,灌胃体积为1 mL/100 g体重。灌胃前隔夜禁食,自由饮水。灌胃后立即观察中毒表现,2 h后喂食。记录中毒症状及死亡时间,持续观察2周,用Horn氏法计算LD50值,按“急性经口毒性分级标准”评价结果。

急性经口毒性分级标准[19]:经口LD50(mg/kg):<5为剧毒,5～50为高毒,50～500为中毒,>500为低毒。若>5000,动物仍不死亡,不需要进行更高剂量的实验。

1.2.8.2 家兔急性皮肤刺激实验 选用无皮肤疾患的健康家兔4只,将躯干中部脊柱两侧皮毛剪短后用8%的Na2S溶液涂抹脱毛,脱毛面积为5×6 cm2,脱毛后24 h确认皮肤无损伤后,将0.5 mL菌剂滴于2×3 cm2大小的4层纱布上,贴敷于一侧脱毛区,盖1层玻璃纸后,用胶布和绷带固定;另一侧为对照,滴等量生理盐水。两侧分别接触4 h后,用温水洗净皮肤。按“皮肤刺激评分标准”评价结果。

皮肤刺激评分标准[19]:A 红斑:无红斑0分,红斑勉强可见1分,红斑明显可见2分,重度红斑3分,紫红色红斑到轻度焦痂形成4分;B 水肿:无水肿0分,水肿勉强可见1分,水肿明显隆起2分,水肿皮肤处隆起1 mm,且轮廓清楚3分,水肿隆起1 mm以上并伴有扩大4分。总积分A+B,最高分值8分。

1.2.8.3 眼刺激实验 选用健康家兔4只,分别取受试物0.1 g,撒入左眼结膜囊内,立即轻闭眼睑约1 min,对照右眼加等量生理盐水。观察动物受药后1、24、48、72、96、168 h后眼结膜、虹膜和角膜的刺激损伤和恢复情况。按照“眼损伤程度”评分[19]。眼损伤程度:

A结膜,观察指标3项,充血状态A1:血管正常充血0分,充血呈鲜红色1分,充血呈深红色血管不易分辨2分,弥漫性充血呈血红色3分。水肿A2:无水肿0分,轻微水肿1分,明显水肿,伴有部分眼睑外翻2分,水肿至眼睑近半闭合3分,水肿至眼睑超过半闭合4分。分泌物A3:无分泌物0分,少量分泌物1分,分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着2分,分泌物使整个眼区潮湿和粘着3分。将动物A1、A2、A3分值相加即为结膜A的损伤情况。最高积分为10。

B虹膜,正常为0,皱折明显加深,充血,肿胀,角膜周围有轻度充血,瞳孔对光仍有反应1分,出血,肉眼可见破坏,对光无反应(或出现其中之一)2分。

C角膜(以最致密部位为准)角膜情况C1:无浑浊为0,弥漫性浑浊,虹膜清晰可见1分,半透明区易分辨,虹膜模糊不清2分,出现灰白色透明区,虹膜细节不清,瞳孔大小明显看清3分,角膜不清楚,虹膜无法辨认4分。角膜受损范围C2:角膜受损程度<1/4为1分,1/4～1/2为2分,1/2～3/4为3分,3/4～1为4分,角膜C受损程度为C1×C2。最高积分16。

眼刺激积分指数(I.A.O.I)=A×2+B×5+C×5,最高积分为110。

1.2.8.4 豚鼠皮肤变态反应(致敏)实验 将20只豚鼠随机分成两组,实验组和阳性对照组。实验组给以生防菌,阳性对照组给以2,4-二硝基氯苯溶液。步骤如下:

A. 致敏接触:实验前24 h将动物背部左侧去毛3×3 cm2。将0.2 mL的菌剂发酵液均匀涂于脱毛区,用2层纱布和1层玻璃纸覆盖,再以无刺激胶布封闭固定,持续6 h后用温水洗去受试物。第7 d和14 d以同样方法重复一次。阳性对照组给以1% 2,4-二硝基氯苯溶液0.2 mL,操作同上。

B. 激发接触:实验前24 h将动物背部右侧去毛2×2 cm2。末次致敏后14 d,将0.2 mL生防菌剂均匀涂于右侧去毛区,操作方法同致敏接触,持续6 h后用温水洗去受试物,每日观察皮肤情况至12 d。阳性对照组给以0.1%的2,4-二硝基氯苯溶液0.2 mL,操作方法同上。

将出现皮肤红斑或者水肿(无论程度轻重)的动物数除以动物总数,求出动物致敏率[19]。

1.2.9 数据分析实验数据 采用Origin 85和Excel 2007软件进行处理分析。Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1生防菌不同发酵时间对草莓果实采后自然腐烂的影响

草莓于6 ℃下贮藏20 d后,结果见图1 A。CK和经无菌水浸泡的果实腐烂指数无显著性差异,其腐烂指数分别为87.96%和89.32%。生防菌经过不同时间的发酵后,与CK比,其腐烂指数有显著性差异,其中发酵24 h的菌液效果最好,腐烂指数为40.15%,与CK比腐烂指数下降了54.35%。草莓于16 ℃下贮藏9 d后(见图1 B),与6 ℃的结果相似,发酵24 h腐烂指数最低为51.43%,比CK下降了43.95%。该实验结果与李静[17]的体外实验相一致,李静发现该菌发酵24 h的平板抑菌圈直径最大,其原因可能是发酵培养24 h时,该生防菌已完成了对数生长期,其活菌数达到最大值,其抑菌活性物质得到最大富集,从而且提高了抑菌活性最强,表现为果实腐烂率最低。

图1 不同发酵时间对草莓自然腐烂的影响Fig.1 Effect on natural decay of strawberries with different fermentation times注：A:6 ℃ 20 d;B:16 ℃ 9 d。

图2 不同处理方式对草莓自然腐烂的影响(16 ℃ 9 d)Fig.2 Effect on natural decay of strawberries with different process ways(16 ℃ 9 d)

2.2生防菌不同处理方式对草莓果实采后自然腐烂的影响

由图2可知,采用喷淋和浸泡的方法均可以降低草莓果实的腐烂。喷淋的方式和浸泡30 s、1、2 min相比,无显著差异,继续增加浸泡时间,浸泡3 min中草莓的腐烂指数最低,为41.00%,与CK相比,其抑制达46.74%。再继续增加浸泡时间为4 min时,草莓腐烂指数略有上升。其原因可能是浸泡时间较短或者喷淋时,菌株不能很好的附着在果实表面,随着时间延长,附着菌液也会增多,能够实现有效定殖,增强抑制能力,而当浸泡时间过长,由于草莓果皮较娇嫩,缺乏保护层,果皮容易造成机械损伤,造成病害侵染,故腐烂指数增加。

2.3生防菌不同处理液对草莓采后自然腐烂的影响

草莓果实经生防菌不同处理液浸泡后,其自然腐烂情况见图3。上清液、5倍稀释上清液和10倍稀释上清液的效果与CK相比无显著差异,而发酵液和菌悬液及它们的5倍、10倍稀释液与CK比有显著差异,说明该生防菌的抑菌活性物质可能不在上清液中。其中,稀释5倍的发酵液效果最好,果实腐烂指数为56.39%,与CK比,腐烂指数下降了37.56%。发酵液稀释5倍后效果反而比发酵原液好,其原因可能是菌株的浓度太高,一些对果实不利的代谢产物分泌也较多,对果实造成一定伤害。

图3 生防菌不同处理液对草莓自然腐烂的影响Fig.3 Effect on natural decay of strawberries with different treatment of B. contaminans注：CK:无菌水；A:发酵原液；B:稀释5倍发酵液；C:稀释10倍发酵液；D:菌悬液；E:稀释5倍菌悬液；F:稀释10倍菌悬液；G:上清液；H:稀释5倍上清液；I:稀释10倍上清液。

2.4生防菌不同处理液对草莓采后灰霉病的影响

生防菌不同处理液对草莓采后灰霉病的抑制效果见表1。从表1中可知,接种5 d后,CK发病达98.20%,病斑达到1.21 cm,发酵原液、稀释5倍发酵液和菌悬液处理均未发病,稀释10倍发酵液轻微发病,发病率为9.00%,而上清液和热杀死液与CK发病率无显著性差异,则抑菌效果好的主要是菌悬液和发酵液,这一结果与自然腐烂结果相似,进一步证明菌体胞外的上清液无抑菌活性,该菌株的主要抑菌物质为菌体细胞。

表1 生防菌不同处理液对草莓灰霉病的抑制Table 1 Inhibitory of different treatments of B. contaminans on Botrytis cinerea

2.5大鼠急性经口毒性实验

经口给药后,大鼠急性经口毒性实验结果见表2。根据急性经口毒性标准,当LD50>5000 mg/kg即杀死一半实验总体时的有毒物质的剂量>5000 mg/kg,可以不用在进行更高剂量的实验,基本可认为该物质是低毒物质,从表2中可以看出,雌、雄性大鼠经口 LD50>5000 mg/kg,且在2周的观察期内受试大鼠无死亡且无其他异常,因此,可认为该生防菌属于低毒物质。

表2 大鼠急性经口毒性实验结果Table 2 Result of acute oral toxicity test on rats

表3 家兔皮肤刺激实验结果Table 3 Result of stimulation on the skin of rabbits

注:刺激强度分级:0～0.4无刺激性,0.5～1.9轻度刺激性,2.0～5.9中等刺激性,6.0～8.0强刺激性。

表4 眼刺激(不冲洗)实验结果Table 4 Result of stimulation on the eyes(no wash)

注:I.A.O.I为0～5,M.I.O.I 48 h后为0为无刺激性;I.A.O.I为5～15,M.I.O.I 48 h后<5为轻度刺激性;I.A.O.I为15～30,M.I.O.I 96 h后小于5为轻度至中等刺激性;I.A.O.I为30～60,M.I.O.I 168 h后小于20为中度刺激性;I.A.O.I为60-80,M.I.O.I 168 h后小于40为中度至重度刺激性;I.A.O.I为80～110为重度刺激性。

2.6家兔皮肤刺激实验

家兔皮肤刺激实验结果见表3,根据皮肤刺激标准评分结果显示,该生防菌没有造成家兔皮肤产生红斑及水肿,经皮肤刺激实验72 h时,家兔皮肤刺激强度仍为无刺激性,因此可判断该生防菌不会对皮肤产生刺激反应。则家兔皮肤刺激实验结果为无刺激性。

2.7家兔眼刺激实验

给药后不洗眼,家兔眼刺激实验结果如表4,从表中可看出,再受药处理后的1、24、48、72、96、168 h时,该生防菌对眼结膜、虹膜和角膜刺激分数均为0,即眼刺激积分指数(I.A.O.I)为0,停止受药后,观察48 h后眼睛损伤恢复情况,眼刺激平均指数(M.I.O.I)48 h为0。实验表明,家兔眼刺激实验不冲洗实验结果为无刺激性。

2.8豚鼠皮肤变态反应(致敏)实验

表5为豚鼠皮肤致敏实验结果。实验期间,阳性对照(2,4-二硝基氯苯)组动物皮肤均出现不同程度的红斑和水肿,皮肤粗糙等;实验组动物皮肤均无红肿,其致敏率为0%,致敏强度I级,属弱致敏物。

表5 豚鼠皮肤致敏实验结果Table 5 Results of dermal allergy reaction on guinea pigs

注:致敏率0～8,致敏强度为Ⅰ级,属于弱致敏物;致敏率9～28,致敏强度为Ⅱ级,属于轻度致敏物;致敏率29～64,致敏强度为Ⅲ,属于中度致敏物;致敏率65～80,致敏强度为Ⅳ级,属于强度致敏物;致敏率81～100,致敏强度Ⅴ级,属于极强度致敏物。

3 结论

伯克氏菌可产生硝吡咯菌素、吩嗪、苯基吡咯、Cepaciamide A、Cepacidine A等多种次生代谢物质,在农业领域中具有生物防治、生物降解以及促进植物生长等多种功能,有广泛应用前景[20-21]。目前已有伯克氏菌用于果实采后相关的报道,范青[22]发现伯克氏菌对甜樱桃果实采后褐腐病表现显著的抑制作用;该菌株可提高果实抗性相关酶POD、SOD、CAT、PPO、PAL等的活性[11]。本次实验的研究表明,生防菌洋葱伯克氏菌B.contaminans可以有效抑制草莓采后病害发生,且24 h发酵液的抑制效果最好。无论是自然腐烂,还是伤口接种,与CK比较均具有显著性的抑制效果。在不同处理液中,菌悬液抑制效果显著,上清液无抑菌性。这为我们研究抑菌机理,提取抑菌活性物质提供了基础理论依据。

Vanlaere[23]认为洋葱伯克霍尔德氏菌种内分为9个基因型,2008年Vanlaere[24]又分出Burkholderiaubonensis和另外5个新种,2009年Elke Vanlaere[25]又分出两个新的基因型Burkholderiacontaminans和Burkholderialata,至此洋葱伯克霍尔德氏菌复合群共包括17个其因型。文献报道[26-27],对人体有致病性的基因型主要是基因型Ⅱ(B.multivorans)、基因型Ⅲ(B.cenocepacia)。本实验中发现BurkholderiacontaminansB-1在动物急性经口毒性实验,皮肤和眼刺激实验及皮肤致敏性实验中,没有毒性,且对皮肤和眼睛没有刺激性,对皮肤也没有致敏性,说明该基因型菌株作为生防菌的人体安全性,具有进一步开发和应用价值。

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