纳米硒桔梗多糖复合物对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用

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(1.佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯 154007;2.佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯 154007；3.多多药业有限公司,黑龙江佳木斯 154007)

众所周知硒是人和动物不可缺少的微量元素[1],研究发现硒与许多疾病有关,如大骨节病、白内障、肝病、癌症等。因硒可以保护肝脏、心脏等免受损伤,近年来愈来愈受关注[2-4]。据资料显示肝病患者普遍缺硒,病情愈重,缺硒愈明显[5]。而适宜补硒可以提高肝病患者的免疫力和抗氧化能力,以便达到保护肝脏、预防肝病的发生[6]。目前,中国营养学会推荐成人应每天摄取50～250 μg的硒来保证身体健康,并呼吁人们应该像每天摄取淀粉、蛋白质一样,每天也必须摄取适量的硒[3,7]。因此开发硒源显得尤为重要。有报道纳米硒是目前为止最安全且生物活性最高的硒形式[8-10],纳米硒作为补硒剂已显示出较强的优势,而制备纳米硒的方法最常用的是模板法,该方法简单,易操作,且制备的纳米硒稳定。如高义霞等以刺槐豆多糖为软模板制备出红色球形纳米硒[11],杨梦涛用牡蛎多糖为模板制备了纳米硒-牡蛎多糖[12]。由于使用的模板不同制备出的纳米硒的尺寸也有所不同,其生物活性差异较大。有关纳米硒生物活性的研究大都集中在免疫和抗氧化能力[13-14]、抗肿瘤细胞[15]、动植物补硒[16-17]等方面,而对其保肝作用的研究甚少,为了探究纳米硒的保肝作用,本文选择了一种没有细胞毒性,不影响细胞正常功能的桔梗多糖为模板[18],在温和的条件下制备具有一定尺度的纳米硒桔梗多糖复合物,用CCl4制备小鼠化学肝损伤模型,通过测定小鼠血清与组织中各项生理指标和肝组织染色,评价纳米硒复合物的保肝作用,旨在为开发硒源、肝病的预防与治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

昆明种小鼠170只(18～22 g,雄性) 哈尔滨医科大学实验动物学部,许可证号:SCXK(黑)2013-001，饲养条件:温度保持在21～24 ℃之间,相对湿度在45%～50%之间,风速为0.1～0.2 m/s,气流≥30次/h；CCl4天津市瑞金特化学品有限公司;联苯双酯滴丸 北京协和药厂;谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)及总蛋白(TP)检测试剂盒 日本和光纯药工业株式会社;丙二醛(MDA)试剂盒和还原型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒 南京建成生物工程研究所;牛血清蛋白 美国Sigma公司;考马斯亮蓝G-250 北京亚米生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯;桔梗 安国振宇中药材饮片有限公司,生产批号:2013814。

AU 2700型全自动生化分析仪和B×41型光学显微镜 日本OLYMPUS公司;JEM-1200EX型透射电子显微镜 日本电子株式会社;WD-2102A型全自动酶标仪 北京六一生物科技有限公司;LG10-2.4A型高速离心机 北京京立离心机有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 桔梗多糖的制备 桔梗→粉碎→取50 g→蒸馏水1500 mL→浸泡12 h→超声提取→浓缩→离心10 min→大于80%(w/v)醇沉→静置12 h→离心→复溶→Sevag法除蛋白→D101大孔树脂脱色→醇沉→桔梗多糖。

1.2.2纳米硒桔梗多糖复合物的制备 于三颈瓶中加入120 mL的桔梗多糖水溶液(100 mg/L),置于40 ℃的水浴锅中搅拌30 min 后,加入8.64 mg的固体Na2SeO3,继续搅拌30 min,以1.5 mL/min的速度滴加 40 mL VC水溶液(3.75 mmol/L),使Na2SeO3与VC在反应体系中的最终摩尔比为1∶3,继续搅拌4 h,分别在410 nm和490 nm处测定吸光度,取A410/A490落在2.0～2.2的溶液,浓缩,冷冻干燥。

1.2.3 透射电镜 用胶头滴管滴加2滴纳米硒桔梗多糖复合物溶液到透射电镜专用铜网上,置于40 ℃烘箱内干燥,放在透射电镜上进行观察。

1.2.4 纳米硒桔梗多糖复合物中硒含量的测定 精密称取0.2 g的负载纳米硒桔梗多糖复合物,按食品中硒含量测定国家标准GB 5009.93-2017[19]荧光法测定硒含量。

1.2.5 急性毒性实验 参考中华人民共和国国家标准GB 15193.3-2014《食品安全国家标准 急性经口毒性实验》,采用霍恩氏法评价纳米硒桔梗多糖复合物的急性毒性[20]。选用昆明种小鼠100只,雄性,随机分为10组,每组10只,饲养一周后,禁食不禁水12 h。根据预实验结果,前5组分别一次性灌胃5、10、20、40和80 mg/kg·bw(按含硒计)的纳米硒桔梗多糖复合物,第6到第10组组分别一次性灌胃给对应剂量的Na2SeO3。连续观察动物两周,每天观察一次,记录动物体貌特征、活动状况及死亡情况。

1.2.6 小鼠肝损伤模型的制备与给药 取昆明种雄性小鼠70只,随机分为7组,每组10只。适应饲养一周后,联苯双酯组灌胃按0.2 g/kg·bw剂量给药,桔梗多糖组灌胃50 mg/kg·bw的桔梗多糖,纳米硒桔梗多糖复合物高、中和低剂量组灌胃分别灌胃31.11、6.22、1.24 mg/kg·bw的纳米硒桔梗多糖复合物,空白组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续灌胃给药14 d;于第7 d和第14 d在给药1 h后,除空白组外,各组小鼠均腹腔注射0.2%(体积分数)的CCl4橄榄油溶液(10 mL/kg·bw)。

1.2.7 肝损伤各项指标的检测 在末次给药24 h后,摘眼球取血,室温离心15 min(3000 r/min),用全自动生化仪测定血清中ALT、AST、ALP 活力,ALB和TP含量。选取小鼠肝脏的相同部位肝组织0.2 g用生理盐水漂洗,制成10%的组织匀浆液,离心,取上清液,按试剂盒说明书测定GSH-PX活力、MDA和蛋白含量。

1.2.8 肝脏指数测定 在末次给药24 h后,给小鼠称重,处死,取肝脏洗净后,吸干水分称重,按公式:肝脏指数(%)=肝重/体重×100计算肝脏指数。

1.2.9 组织病理学观察 取相同部位肝大叶用甲醛固定,按常规方法制备蜡块,切片,HE染色,在光学显微镜下放大200倍进行病理学检查。

1.2.10 统计学处理 用统计SPSS 18.0软件包进行统计分析,多组计量资料分析采用SPSS中的单因素方差分析法(One-Way Anova),多重比较采用SPSS中的最小显著性法(LSD)。

2 结果与讨论

2.1纳米硒桔梗多糖复合物的形貌表征

如图1所示,纳米硒桔梗多糖复合物为球状,且大小均一、分散较均匀。溶液放置2个月后仍呈透明红色液体基本无沉降,X射线衍射显示其固体为晶型粉末。

图1 纳米硒桔梗多糖粒子透射电镜图Fig.1 TEM picture of nanometer selenium particals

2.2纳米硒桔梗多糖复合物的粒度与硒含量测定

经透射电镜测量,纳米硒在桔梗多糖模板中的平均粒度约为50 nm,纳米硒桔梗多糖复合物中含硒量平均为4.02%。

表2 小鼠血清中生化指标的测定结果Table 2 Results of biochemical indexes in serum of mice

2.3纳米硒桔梗多糖复合物的急毒实验与分析

给药1周后,灌胃给纳米硒桔梗多糖复合物40和80 mg/kg·bw(按含硒计)剂量组的小鼠开始出现食欲不振,毛色变黄,体重下降现象,其中80 mg/kg·bw(按含硒计)剂量组的小鼠随给药天数的增加出现了尾部变紫,个别出现粪便颜色变红的严重中毒症状;2周五组小鼠死亡统计依次分别为0、0、0、10%和30%,其LD50值无法求出;同剂量的Na2SeO3组小鼠除以上现象外,随剂量增加还出现抽搐、轻微的呼吸困难等症状,死亡率依次为0、30%、60%、70%和100%,经计算LD50为0.76 mg/kg·bw(以硒计)。以上结果表明纳米硒桔梗多糖复合物的毒性小于Na2SeO3。

2.4纳米硒桔梗多糖复合物对小鼠肝脏指数的影响

由表1可知,CCl4模型组与空白组小鼠比较肝脏指数显著升高(p<0.01),这可能是由于CCl4造成了肝损伤引发了肝肿胀的结果。与模型组比,联苯双酯组小鼠肝脏指数显著降低(p<0.01),说明联苯双酯滴丸对CCl4导致的小鼠肝肿胀具有良好的抑制作用。桔梗多糖低剂量组与空白组比较肝脏指数显著增大(p<0.05),说明桔梗多糖低剂量组对CCl4导致的小鼠肝肿胀有一定的干预作用,但作用较弱;不同浓度的纳米硒桔梗多糖复合物组与模型组比较,中、高剂量组肝脏指数显著降低(p<0.01),低剂量组的肝脏指数降低不显著(p>0.05),说明了纳米硒桔梗多糖复合物中的纳米硒发挥了抑制肝损伤的作用,并随着剂量的增大而作用增强。总之,从以上肝脏指数测量的结果分析可知:纳米硒桔梗多糖复合物对CCl4导致的小鼠肝肿胀均有一定的抑制作用,可推测纳米硒桔梗多糖复合物对小鼠的肝脏具有一定的保护作用。

表1 小鼠肝重指数测定结果Table 1 The results of liver weight index of mice

注:与空白组相比,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*:p<0.05,**p<0.01;表2和表3同。

2.5纳米硒桔梗多糖复合物对小鼠血清生化指标的影响

图3 肝组织HE染色结果Fig.3 the results of HE staining of liver tissue

由表2可知,CCl4模型组与空白组比小鼠血清中ALT、AST和ALP水平显著升高(p<0.01),而TP和ALB含量显著降低(p<0.01),说明造模成功。联苯双酯组与空白组比小鼠血清生化指标ALT、AST、ALP、TP和ALB均无显著差异(p>0.05),表明联苯双酯滴丸可显著改善CCl4引发的小鼠肝损伤。纳米硒桔梗多糖复合物高、中、低剂量组和桔梗多糖组与模型组比小鼠血清中ALT、AST和ALP活力显著降低(p<0.01,p<0.05),其降低的程度大小顺序为:纳米硒桔梗多糖复合物高剂量组>纳米硒桔梗多糖复合物中剂量组>纳米硒桔梗多糖复合物低剂量组>桔梗多糖;而TP和ALB含量显著升高(p<0.01,p<0.05),各组升高的程度的大小为:纳米硒桔梗多糖复合物高剂量组>纳米硒桔梗多糖复合物中剂量组>纳米硒桔梗多糖复合物低剂量组>桔梗多糖,结果表明:纳米硒桔梗多糖复合物具有保护肝脏免受CCl4的影响。

2.6纳米硒桔梗多糖复合物对肝组织中GSH-Px活力和MDA含量的影响

由表3可知,与空白组比较,模型组小鼠肝组织中GSH-Px活力和MDA含量均显著升高(p<0.01),表明肝组织发生氧化应激。联苯双酯组与模型组比较GSH-Px活力和MDA含量显著降低(p<0.01),与空白组比较GSH-Px活力和MDA含量均无显著性差异。纳米硒桔梗多糖复合物的高、中剂量组与模型组小鼠比较,肝组织中GSH-Px活力和MDA含量均显著降低(p<0.05,p<0.01),而桔梗多糖治疗组、纳米硒桔梗多糖复合物低剂量治疗组与模型组相比GSH-Px活力和MDA含量都有不同程度的降低(p<0.05),与空白组比GSH-Px活力和MDA含量有不同程度的升高(p<0.01),这表明桔梗多糖和纳米硒桔梗多糖复合物对CCl4所导致的小鼠肝损伤均起到了一定保护作用;其保护作用的大小为:纳米硒桔梗多糖复合物高剂量组>纳米硒桔梗多糖复合物中剂量组>纳米硒桔梗多糖复合物低剂量组>桔梗多糖,且纳米硒桔梗多糖复合物高剂量组的治疗效果与阳性药物联苯双酯的治疗效果相近保护作用最好。纳米硒桔梗多糖复合物对肝脏的保护作用可能源于对硒的吸收,因为纳米硒的纳米微粒表面的原子数及悬键和不饱和键更多,使其具有高的表面活性[21],更易于被吸收。由于硒的吸收在体内可形成谷胱苷肽过氧化酶,它能够分解血液中的脂质过氧化物,可引起机体的过氧化物酶活力降低。

表3 小鼠肝组织中MDA 的含量和GSH-Px 的活力Table 3 Contents of MDA and Activity of GSH-Px in liver tissue

2.7组织病理学结果

由图3可知,空白组小鼠肝组织结构清晰,肝小叶结构清晰,肝细胞索排列规则,没有病变、坏死的肝组织;模型组肝细胞形态模糊,肝小叶结构紊乱,细胞核出现许多空泡,大小不一,细胞坏死,水肿现象严重;联苯双酯组小鼠肝小叶结构基本清晰,肝细胞炎性反应明显降低;桔梗多糖组、纳米硒桔梗多糖复合物低剂量组细胞结构模糊、排列紊乱,部分细胞核有空泡,但相对于模型组有一定的改善;纳米硒桔梗多糖复合物中剂量组和高剂量组小鼠肝细胞排列整齐,没有细胞水肿,表明肝细胞没有受到损伤,说明纳米硒桔梗多糖复合物明显地保护了肝组织。

3 结论

本实验证实桔梗多糖和不同剂量的纳米硒桔梗多糖复合物对CCl4造成的小鼠肝损伤有不同程度的保护作用,其保肝效果:纳米硒桔梗多糖复合物高剂量组>中剂量组>低剂量组>桔梗多糖。且中、高剂量的纳米硒桔梗多糖复合物对肝损伤治疗效果最好,与联苯双酯滴丸的疗效相近。因此,本实验找到了一个较好的制备纳米硒的新模板——桔梗多糖,从而提高了桔梗植物的利用价值。实验也证明了纳米硒桔梗多糖复合物的保肝作用强于桔梗多糖本身。本文为开发新型的含硒保肝药物提供了一定的科学依据,也为其它活性的进一步研究与开发奠定了基础。

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