多肽体内外肺癌靶向性鉴定研究

张正兵，臧林泉*

（1.漳州卫生职业学院，福建 漳州 363000；2.广东药科大学，广东 广州 510006）

恶性肿瘤将是21世纪人类的“头号杀手”，2014年世界卫生组织预测，到2025年全球癌症新发病人数将达到1900万，而我国2015年新增癌症病例达到429万，占全球癌症病例数的首位[1-2]。目前恶性肿瘤的药物治疗主要还是依靠传统的细胞毒类药物进行临床化疗，给恶性肿瘤病人带来严重的不良反应。小分子多肽具有分子量小、靶向性强、活性高、毒性弱、易于穿膜吸收等特点，在肿瘤靶向性研究领域特别是造影剂、肿瘤靶向性前体药物的开发和研究中具有重要的意义[3]。近年研究较为热门的是多肽作为靶向给药载体的研究，特别是以整合素为受体的相关配体作为载体的研究。迄今为止，出现了许多以整合素为受体的抗血管生成的疗法，其中包括有多肽、抗体、小分子干扰核糖核酸（siRNA）以及联合用药的靶向给药等[4]。

1 材料与仪器

1.1 主要试剂和仪器

荧光倒置显微镜（德国Leica）；V7型快速混匀器（美国Essenscien公司）；独立送回风净化笼具（IVC）（苏州市苏杭实验动物设备厂）；AUY120型电子天平（日本岛津公司）；多肽FITC-Peptide1-10号（课题组设计，北京中科亚光多肽公司合成）；多聚甲醛（北京鼎国生物有限公司），OTC冷冻切片包埋液（北京鼎国生物有限公司），免疫组化专用载波片（广州瑞舒生物有限公司）。

1.2 实验动物

健康裸鼠，约4周龄左右，雌雄各半，体重在18～22 g，购置于中山大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（粤）2011-0029。

1.3 标本

人肺腺癌细胞系NCI-H1299，购自中科院上海细胞所；肺癌组织芯片，购自桂林泛谱生物技术有限公司，批号LUC1501。

2 实验方法

2.1 FITC标记多肽在荷瘤裸鼠体内组织分布

以尾静脉注射方式将2mg/mL FITC标记的多肽（1-10号）注入裸鼠体内，500 μL/只，同时以FITC作为阴性对照，10 min后乙醚麻醉裸鼠，横隔水平切开皮肤，暴露全部胸壁，小心剪断胸骨，避免损伤心脏和肿瘤供血血管；充分暴露心脏后，通过左心室用静脉针穿刺入主动脉，同时在右心耳处剪开一小口，缓慢推注生理盐水进行灌流，直至流出的血液变成淡红色为止。换用4%多聚甲醛灌流，40%蔗糖脱水，待裸鼠肢体变硬即可，立刻取裸鼠皮下的瘤块，OTC包埋后制备冰冻切片（10 μm），荧光倒置显微镜下观察荧光强度并拍照。

2.2 FITC标记多肽的组织免疫荧光化学鉴定

取人肺癌组织芯片（LUC1501）于60℃烘箱中固定30 min，取出后按以下步骤脱蜡。脱蜡步骤如下：将组织芯片按顺序浸泡于以下溶液中：二甲苯30 min、二甲苯10 min、100%乙醇10 min、90%乙醇10 min、80%乙醇10 min、70%乙醇10 min、50%乙醇10 min，在恒温摇床上用PBS洗3次，5 min/次。抗原修复，采用晶芯微阵列芯片扫描仪对组织芯片的荧光进行扫描分析。以单独FITC作为阴性对照，重复三次实验，统计阳性率、假阳性率。

3 结 果

3.1 FITC标记多肽（1-10）在荷瘤裸鼠体内组织分布

结果显示，在10条备选多肽中，3号多肽和7号多肽对肺癌NCI-H1299体内移植瘤组织具有较高的亲和力和特异性，直接反应在荧光强度上较其他条肽高。3号肽和7号肽主要浓集于裸鼠肿瘤组织中，呈明亮的绿色荧光，结果见图1。

图1 FITC标记多肽（1-10号）在肺癌NCI-H1299裸鼠肿瘤组织分布情况（100×）

图2 FITC标记多肽与人肺癌组织芯片的免疫荧光鉴定，图中红色框内为正常组织，蓝色框内为肺炎组织，黄色框内为记号点，其余组织为各类型肺癌组织

3.2 FITC标记多肽的组织免疫荧光化学鉴定

实验结果见图2所示，芯片包括70例不同类型肺癌组织，5例正常及炎症等组织。肺癌组织主要是肺鳞癌组织，肺腺癌组织，肺腺鳞癌组织，肺泡癌组织，乳头状腺癌组织，以及转移癌组织等。本实验中没有出现脱片现象，以荧光强度＞2倍肺炎和正常组织荧光强度为阳性，三张芯片取平均值统计阳性率和假阳性率，同时以单独FITC作为阴性对照，对1-10号FITC标记多肽的靶向性情况进行统计。

统计结果显示，1-10号多肽对肺癌诊断的阳性率分别为27.3%、28.2%、32.1%、21.4%、10.7%、18.2%、28.4%、19.3%、13.6%、12.9%，而FITC的阳性率为1.43%。结果表明，3号多肽和7号多肽的阳性率较其他条多肽高，表明3号肽和7号肽与肺癌各个组织的结合率高。3号多肽的阳性率最高，但是有20%的假阳性率，而7号多肽虽在阳性率28.4%较3号肽32.1%低，但是假阳性率为0%。实验结果提示3号肽和7号肽均可用于后续的实验。见表1。

表1 FITC标记多肽与人肺癌组织芯片的免疫荧光统计结果（n=3）

4 结 语

目前国内外开发的以RGD为配体的靶向肿瘤血管的药物已屡有报道，整合素配体—药物复合物以及以整合素配体为靶向的药物小分子探针多有研究[5-6]，例如含有RGD（Arg-Gly-Asp）序列的环状5肽西仑吉肽，用于靶向性治疗非小细胞肺癌、胰腺癌和肉瘤等实体瘤。

本实验待筛选的多肽基于RGD肽设计而来，从组织切片实验中发现3号和7号多肽在荷瘤裸鼠肺癌移植瘤组织中具有较强的荧光分布，提示待筛选多肽与整合素受体可能有较高的亲和力。组织芯片鉴定结果显示3号肽和7号肽具有较高的阳性结合率，但3号肽同时也伴有20%的假阳性率，而研究表明恶性肿瘤的发生和发展常伴有前期炎症的产生，肿瘤本身在生长的过程中随着体积的增大，内部肿瘤细胞血流量减少，提供的营养物质不足以支撑其生长所必需的能量要求，内部细胞出现化脓炎症等现象，伴随着炎症的产生的，并通过特异性的信号转导通路进一步促进或诱导肿瘤的发生[7-8]。通过体内组织切片和体外组织芯片鉴定结果提示，3号多肽和7号多肽具有靶向性结合肺癌组织的作用，未来在靶向性抗肺癌新药研究中具有重要的意义。

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