慢性丙肝患者高通量测序TCR-CDR3免疫组库研究

张园海，葛国洪，陶 艳，邵江波，吴 迪

（江苏大学附属镇江三院肝炎科，江苏 镇江 212000）

目前据世卫组织统计，全球感染HCV人群约有1.85亿，55～85%成为慢性丙肝，部分人群发展为肝硬化及原发性肝癌。每年死于HCV感染相关病例约35万例。丙肝的发病机制可能与宿主感染HCV后引起的T淋巴细胞免疫反应有关[1,2]。每一种特异的T淋巴细胞表面表达一种特异性的T淋巴细胞抗体（TCR），识别抗原和介导免疫应答。TCRβ基因可变区有三个互补决定区（CDR），其中CDR3是其主要决定区。故研究CDR3序列的特异性与多样性对于识别TCR具有重要意义[3-5]。本研究利用高通量测序技术来研究分析慢性丙肝患者外周血中TCR-CDR3免疫组库特性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院收治的慢性丙肝患者6例血液标本，均来自我院门诊患者，诊断均符合2000年病毒性肝炎防治方案。入选时排除合并甲肝、乙肝、戊肝以及HIV等感染，排除自身免疫性疾病、酒精性肝病、脂肪肝、血吸虫肝病、恶性肿瘤等。所有入选病例均未进行抗病毒治疗。

1.2 T淋巴细胞分离并提取RNA

取各研究对象血液标本10 mL，采用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，用免疫磁珠分离法去除B细胞、NK细胞（INVITROGEN Dynabeads®Untouched™ Human T Cells试剂盒）。分离得到的T细胞（细胞数量约为1 X 106）立即提取RNA。

cDNA一链的合成，进行多重PCR扩增：提纯总RNA后，合成cDNA一链（TOYOΒO的ReverTra Ace -α-TM试剂盒）。进行5 min 95度活化热启动，30秒95度变性，60度退火90秒，72度延伸90秒，反复循环35个，再予68度末次延伸。Βioannalyzer分析产物质量。扩增产物可放置2～8°C过夜，然后放置于–20°C长期保存。

2 结 果

2.1 慢性丙肝患者TCR-CDR3免疫组库的建立

收集慢性丙肝病例6例（具体资料见表1）运用Illumina Miseq测序平台测序，得到6例HCV患者外周CD4T细胞共1683286个TCRβV基因CDR3序列，建立HCV患者外周血TCR-CDR3免疫组库。去除冗余后的氨基酸序列，得到CDR3 有效序列151246个。6例患者其CDR3序列数385787～215883。去除冗余氨基酸序列，得到有效序列在33936～17271。

表1 入选慢性丙肝患者一般资料

2.2 各样本V区、J区基因使用频率分布

入选的6名HCV感染病例，其CDR3序列氨基酸长度，主要为11（25.5%），12（24.17%），13（16.33%），其次为10（9.5%），14（7.5%），类似于正态分布，符合正常个体的CDR3长度分布。TCRβ链的V区基因共59个亚型，使用频率分布，TRBV-2（18.83%），TRBV-15（12.17%），TRBV-19（11.17%），TRBV-30（7.33%），TRBV29-1（4.5%），TRBV5-1（4.0%）。（见图1）TCRβ链的J区基因共14个亚型，其使用频率分布，主要为TRBJ1-1（24.33%），TRBJ2-7（18.33%），TRBJ2-3（11%），TRBJ2-5（9%），TRBJ1-2（8%），TRBJ2-1（7.83%），TRBJ2-2（6.5%），TRBJ1-4（5.33%），TRBJ1-5（4.67%）。（见图2）

图1 TCRβ链的V区基因使用频率分布

图2 TCRβ链的J区基因使用频率分布

2.3 各样本V区-J区基因结合情况分布

将6个样本的TCRβ链的CDR3受体库，V-J基因取用配对情况分析显示：各样本均存在高频配对TRBJ1-1–TRBV19，6号样本（4%）、5号样本（1%）、3号样本（8%）、4号样本（2.5%）、1号样本（3%）、2号样本（5%）。，其均值为3.92%。同时也存在高频配对TRBJ1-1–TRBV2，6号样本（2%）、5号样本（1%）、号样本3（5%）、4号样本（3%）、1号样本（3%）、2号样本（5%），其均值为3.17%。在统计学上，将其用皮尔森相关系数分析得r=0.83。见表2。

表26个样本V区-J区基因结合情况分布

3 讨 论

HCV感染易慢性化，导致肝硬化、原发性肝癌。其与宿主免疫、遗传易感性、以及病毒分型等有关，慢性丙肝既是一种病毒感染性疾病，也是一种免疫性疾病。其中HCV特异性T淋巴细胞免疫在决定患者感染结局方面起主要作用，而体液免疫对其作用微弱[1,6]。

TCR是T淋巴细胞表面的特异性识别抗原分子，介导免疫应答。外周血中T细胞主要为TCRα/β的T细胞，是介导免疫应答的反应的主要细胞。其中CDR3为主要高变区，由V、D、J进行重排，促成了其多样性[7,8]。

本研究中，采用Illumina Miseq高通量测序平台对6例HCV感染患者CDR3进行测序，分析其V区、J区免疫学特征。研究观察到，6例HCV患者TCRCDR3有效序列多的达385787，少的有215883个，其个体差异大。TCRβ链的V区基因使用频率分布最高的前3位是TRBV-2（18.83%），TRBV-15（12.17%），TRBV-19（11.17%）。TCRβ链的J区基因使用频率分布最高的3位，主要为TRBJ1-1（24.33%），TRBJ2-7（18.33%），TRBJ2-3（11%），TRBJ2-5（9%）。将其V-J基因取用配对情况分析可见，5号样本配对比例最高的是TRBJ1-1–TRBV29-1（16%），而在6号样本却连0.5%都不到。2号样本最多的TRBJ2-3–TRBV15（14%），在6号样本中达12%，但在其他4个样本中均不到0.05%。提示各样本均有其个体差异[9，10]。观察比较各样本，仅在TRBJ1-1–TRBV19（3.92%），TRBJ1-1–TRBV2（3.17%），6个样本具有一致性，均存在高频配对一致性。在统计学上，将其用皮尔森相关系数分析得r=0.83，具有正相关。推测其TRBJ1-1–TRBV19、TRBJ1-1–TRBV2可能参与HCV感染的发病、免疫应答等[11]。但本研究病例有限，仍需扩大研究病例证实。

[1] WackA,SoldainiE,Tseng C,et al.Βinding of the hepatitis C virus envelope protein E2 to CD81 provides a co-stimulatory signal for humanTcells[J].Eur J Immunol,2001,31(1):166-175.

[2] Yao ZQ,Nguyen DT,Hiotellis AI,et al. Hepatitis C virus core protein inhibits humanTlymphocyte responses by a complement dependent regulatory pathway [J].J Immunol,2001,167(9):5264-5272.

[3] Spangenberg HC,Viazov S,KerstingN,et al.Intrahepatic CD8+T-cell failure during chronic hepatitis C virus infection.Hepatology,2005,42(4):828-837.

[4] 张建波,方毅敏,黄 艳,等.活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析.中国免疫学杂志,2007,23:1136-1143.

[5] Zhang GW,Yao XS,Ma SW,et al.Analysis ofTcell receptor ΒV dominant usage and CDR3 sequences during acute exacerbation in patients with chronic hepatitis Β.Chinese Journal of Hepatology,2006,14(1):23-8.

[6] Glanville J,Zhai W,Βerka J,et al.Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A.2009,106(48):20216-21.

[7] Freeman JD,Warren RL,Webb JR,et al.Profiling theT-cell receptor beta-chain repertoire by massively parallel sequencing. Genome Res,2009,19(10):1817-24.

[8] Wang,C.et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among humanTcell subsets.Proc Natl Acad Sci USA,2010,107:1518-23.

[9] Βoyd SD,Marshall EL,Merker JD,et al.Measurement and clinical monitoring of human lymphocyte clonality by massively parallel VDJ pyrosequencing.Sci Transl Med,2009,1(12):12-23.

[10] Robins HS,Campregher PV,Srivastava SK,et al.Comprehensive assessment ofT-cell receptor beta-chain diversity in alphabetaTcells.Βlood,2009,114(19):4099-4107.

[11] Weinstein,J.A.Jiang, N.White R.A.et al.High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire.Science,2009,324:807-10.