胸腺重建的研究进展①

余邹邹 胡丽环 徐倩兰 宋银宏

(三峡大学医学院,宜昌 443002)

胸腺是维持外周免疫的重要器官，为T细胞前体发育为成熟的T淋巴细胞提供了重要微环境[1]。T细胞在免疫系统调节中起核心作用[2]，其对病原体及肿瘤产生特异性免疫应答，对自身抗原保持耐受，可以避免自身免疫病的发生。

胸腺体积在青春期之前达到最大值，随后开始萎缩[3]。胸腺的衰退与个体衰老或病理损伤有关，导致成熟的T细胞输出量减少。修复衰退胸腺的功能对于维持T细胞免疫应答至关重要[4]。

除了增龄性胸腺衰退，造血干细胞移植、骨髓移植和实体器官移植前的化疗、放疗、免疫抑制治疗和抗体治疗均会造成胸腺的急性损伤，导致T细胞再生延迟[5]。免疫重建是移植成功的重要组成部分。胸腺非依赖性T细胞扩增与初始T细胞的产生缺陷及记忆T细胞的改变有关，从而导致T细胞的多样性降低，降低了免疫应答并增加了机会致病菌感染和疾病复发的风险[6]。

因此，研究重建增龄性胸腺衰退和移植后胸腺功能与T细胞功能恢复的方法并探讨相关机制，对于预防及治疗临床衰老性疾病及移植后的感染和肿瘤发生具有重要意义。

1 细胞过继免疫重建胸腺并促进T细胞再生

1.1过继胚胎干细胞来源的胸腺上皮祖细胞样细胞 胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)是产生胸腺上皮细胞的可靠来源，Sun等[7]通过实验模拟胸腺器官发育，连续调控活化素、视黄酸、BMP和Wnt信号通路，诱导人ESCs分化成为胸腺上皮祖细胞样细胞(Thymic epithelial progenitor-like cells,TEPLCs)。人ESC来源的TEPLCs表达关键的核转录因子FOXN1，并能在体内进一步发育成为胸腺上皮细胞，表达功能性胸腺标记MHCⅡ和自身免疫调节因子(Autoimmune regulator,AIRE)。TEPLCs驱动的胸腺上皮细胞能促进T细胞缺乏的小鼠生成淋巴细胞，并促进移植了人ESCs的非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(Non-obesity diabetes/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠体内产生人T细胞。Lai等[8]将小鼠ESC来源的胸腺上皮祖细胞(Thymic epithelial cell progenitors,TEPs)注射到骨髓移植(Bone marrow transplantation,BMT)后的成年小鼠体内，TEPs可发育成TECs并促进T细胞生成，增强外周T细胞数量和功能。这一方法并不会诱导移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease,GVHD)，但是移植物抗肿瘤活性明显增强。重要的是，宿主能耐受重建的免疫系统，包括对小鼠ESC和骨髓供体抗原的耐受。因此ESC来源的TEPs可能提供了一种快速而有效的方法，用于在BMT后改善T细胞免疫缺陷，并诱导对ESC来源的组织和器官移植的耐受。移植小鼠ESC来源的TEPs也可增强衰老小鼠同基因移植受体的胸腺细胞生成，逆转了增龄性胸腺衰退，这为增强老年人免疫功能从而降低感染风险提供了思路[8]。

1.2过继幼年增殖胸腺上皮细胞 Kim等[3]通过异时异种共生观察到，幼年小鼠的循环因子不足以驱动衰老胸腺的重建。实验发现，将幼年小鼠的TECs移植到衰退或有缺陷的胸腺中，其在胸腺中可定植并具有功能，促进胸腺生长并增加T细胞生成。胸腺内移植和体外移植形成实验证实：在小鼠出生后1 d，TECs的移植和增殖能力已经开始减弱。与之相反的是，胸腺接受TECs移植的能力不随年龄的增长而衰退，但是TECs克隆形成细胞随着年龄增长而减少。Kim等[3]的实验结果证实：胸腺的生长及衰退是由具有增殖能力的TECs的细胞内在变化所驱动，也进一步证明，幼年的TECs可以移植并直接驱动胸腺的生长，并具有恢复T细胞再生的能力。

1.3过继间充质干细胞 肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)能促进许多种类的细胞增殖。Jung等[1]证实使用干细胞依赖的HGF基因疗法能增强急性损伤后的胸腺重建：通过脂质体转染含有HGF的pMEX 表达载体，产生HGF过表达的人类脂肪组织来源的间充质干细胞(HGF-overexpressing human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,HGF-hATMSCs)。HGF-hATMSCs产生的HGF能增强小鼠胸腺上皮细胞系的增殖和体外IL-7的表达。将HGF-hATMSCs过继给急性胸腺损伤小鼠，其胸腺的大小、质量、胸腺细胞(尤其是早期胸腺祖细胞)和CD4-/CD8-在胸腺中的数量都有明显的增长。因此HGF-hATMSCs具有刺激胸腺细胞再生的作用。

1.4直接过继造血祖细胞 尽管造血干细胞移植可以治疗重症联合免疫缺陷患者，但对于存在淋巴细胞发育基因失调的个体，仍需要额外的方法提高其T细胞免疫能力。Tuckett等[9]利用影像引导的胸腺内注射方法将造血干细胞和造血祖细胞注射入非肥胖型糖尿病及IL2受体γ链缺失的重症联合免疫缺陷(NOD-SCID IL2rγnull,NSG)小鼠体内，有效促进了功能性T细胞再生并保护其免疫力。Tuckett等发现过继同种异体造血细胞后的胸腺重建在幼年雄性小鼠体内最显著，其研究结果还表明：即使在严重的免疫缺陷条件下，性别和年龄仍是影响胸腺功能的重要因素；同种异体T细胞在体内表现出抗淋巴瘤活性，但是没有严重的自身免疫反应和同种异体反应，也就意味着免疫失调不是主要考虑的因素。因此在严重联合免疫缺陷小鼠胸腺内注射造血干细胞和造血祖细胞，是建立、保护T细胞免疫功能安全有效的方法。

2 免疫分子或转录因子相关分子使胸腺重建并促进T细胞再生

Zhang等[10]2014年报道，射线照射小鼠与未照射小鼠相比较，淋巴多能祖细胞和共同淋巴样祖细胞进入胸腺的数量减少10倍以上。射线照射后，小鼠胸腺归巢细胞数量伴随CCL25减少而显著减少。Zhang等[10]实验证实，用CCL25和CCL21预处理骨髓祖细胞，能增加辐射后胸腺归巢细胞的数量，并促进胸腺重建。Hsieh等[11]2015年报道，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)与IL-7融合细胞因子(GIFT7)可增强胸腺皮质的增生，并促进CD44intCD25-双阴性1(Double negative 1，DN1)胸腺祖细胞的扩增。用GIFT7体外处理DN和SPCD8+(single positive CD8+)细胞，能阻止细胞凋亡。在正常幼年小鼠体内，GIFT7可诱导短暂的胸腺增生，且能逆转增龄性胸腺衰退并扩增CD44intDN亚群。在衰老小鼠感染巨细胞病毒后，GIFT7介导的淋巴细胞再生使病毒特异性CD8+细胞的数量明显增加。Lucas等[12]随后发现淋巴毒素β受体(Lymphotoxin β Receptor,LTβR)在正常条件和骨髓移植后均能控制T细胞祖细胞进入胸腺。实验证实：LTβR调节黏附分子在胸腺内的表达，而这些黏附分子在诱导T细胞祖细胞归巢中起重要作用。最终，抗体介导的LTβR在体内通过刺激胸腺基质表达黏附分子，从而促进骨髓移植后早期的胸腺恢复，并增加供体来源T细胞数量。因此，Lucas等揭示了胸腺定植中LTβR与胸腺基质细胞之间联系，以及作为一种新的促进移植后T细胞重建的免疫靶点。Tormo等[13]最近报道，对同种异体BMT模型小鼠腹膜内注射IL-21，发现IL-21可以增强模型小鼠的免疫重建，其主要机制是触发骨髓Lin-Sca1+c-kit+(LSK)亚群的增殖。外周初始CD4+和CD8+T细胞完全重建与正常TCRvβ分布只在IL-21治疗小鼠体内存在，而对照组无。接受IL-21的BMT模型小鼠没有产生GVHD，但保留了移植物抗肿瘤作用。实验还发现，人IL-21能明显提高移植了脐带血的NSG小鼠体内CD3+T细胞的数量。因此Tormo等[13]认为IL-21是一类新的能在BMT后重建胸腺功能的细胞因子。

转录因子在胸腺发育及T细胞生成中起重要作用。Bredenkamp等[14]证实，上调衰老小鼠胸腺中TEC特异性转录因子FOXN1基因，能使胸腺重建及T细胞再生。通过上调FOXN1基因，重建的胸腺器官在结构和基因表达谱上与幼年的胸腺极其相似。上调FOXN1能够本质上逆转增龄性胸腺衰退，因此通过直接操纵单个转录因子FOXN1就能重建衰老哺乳动物的胸腺器官。Song等[15]克隆并表达了穿膜肽与FOXN1的重组蛋白(recombinant FOXN1,rFOXN1)。实验结果表明：rFOXN1能从细胞膜转移到细胞质和细胞核中。通过胸腺内注射，调控rFOXN1进入造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)后的小鼠体内，能使TECs数量增加，且TECs的总数及淋巴细胞生成增加具有rFOXN1剂量依赖性，rFOXN1的处理能够增加早期胸腺祖细胞及所有胸腺细胞亚群的数量。因此rFOXN1有望用于促进接受HSCT患者T细胞再生。最近Lopes等[16]报道，在胸腺重建的早期，核因子κ B受体活化因子配体(Receptor activator for nuclear factor-κ B ligand,PANKL)在CD4+胸腺细胞及淋巴组织诱导细胞(LTi)中上调，中和RANKL会逆转辐射后TEC的恢复。在BMT手术后，RANKL治疗促进了包括胸腺上皮祖细胞在内的胸腺上皮细胞亚群的再生、淋巴祖细胞的胸腺归巢及新的胸腺生成。其机制在于RANKL特异地增加了淋巴毒素α(Lymphotoxin α,LTα)在LTi中的表达，而LTα对胸腺再生起关键作用。

3 信号通路影响胸腺重建及T细胞再生

Song等[17]通过c-Met(ft/ft)小鼠和CD4-Cre转基因小鼠杂交产生T细胞特异性缺乏c-Met的条件敲除(conditional knock out,cKO)小鼠，研究c-Met信号在胸腺细胞发育和修复中的作用。实验表明，成年及衰老的cKO小鼠与野生型小鼠相比，虽然胸腺细胞总数和胸腺细胞亚群的数量相差不大，但是cKO小鼠更容易遭受亚剂量射线和地塞米松处理造成的损伤，即c-Met敲除小鼠在胸腺受损后，其胸腺不易重建，T细胞不易再生。实验结果还表明，6月龄与12月龄cKO小鼠与野生型小鼠相比，胸腺细胞总数和胸腺细胞亚群数量明显下降，并且12月龄cKO小鼠的胸腺结构与20月龄野生型小鼠的胸腺结构相同。由此可知，c-Met在胸腺损伤后的重建中有重要作用，T细胞敲除c-Met基因后加速了增龄性胸腺衰退。

Shen等[6]通过调控GSK-3β抑制因子6-bromoindirubin 3′-oxime (BIO)活化Wnt/β-catenin信号通路，提高了初始T细胞的比例，使移植有人类造血干细胞的淋巴系统衰竭小鼠体内稳态性T细胞扩增过程中T淋巴细胞分化延迟。在体外，BIO的处理促进了丝裂原刺激后初始T细胞的扩增，并促进T细胞对同种异体刺激的增殖反应。BIO下调了效应细胞分化过程中活化基因的表达，同时维持初始T细胞基因的表达。因此，调控GSK-3β抑制因子提高了HSCT受者体内的T细胞的潜能，其机制是通过扩增具有多样T细胞受体库的初始T细胞亚群实现的。

4 利用生物工程方法重建胸腺并促进T细胞再生

Tajima等[4]开发了一种新的水凝胶系统来促进TEC聚合的形成。利用荧光活化的细胞分选技术(Fluorescence-activated cell sorting,FACS )从胸腺的单个细胞中富集TEC，并用抗上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗体标记，然后和抗His的IgG一起锚定在蛋白A/G的复合物上。TEC与EAKIIH6和EAK16-Ⅱ寡肽共孵育促进了细胞聚集。然后通过增加介质的离子浓度启动凝胶化。移植入无胸腺裸鼠体内后，TEC聚集并嵌入EAK水凝胶，能有效促进T细胞的功能发育。

Fan等[18]构造了去除细胞的小鼠胸腺基质三维支架，其在培养基中能维持胸腺上皮细胞活性与独特的分子功能。将构建的胸腺类似器官移植到裸鼠体内，能有效促进淋巴细胞祖细胞归巢和淋巴细胞生成。Fan等证实：通过生物工程构建的胸腺类器官能恢复胸腺功能，并提供了胸腺重建技术在器官移植和再生医学中的临床价值。

5 小结与展望

胸腺是一个与其他器官表现不同的特殊器官。它对急性损伤极其敏感，并能迅速衰退。但胸腺有巨大的潜力恢复其功能。随着年龄增长，胸腺再生能力逐渐降低。因此重建胸腺功能并促进T细胞再生是应对增龄性胸腺衰退与医源性胸腺损伤的重要手段。在以往胸腺重建的方法中，多通过细胞因子如：角化细胞生长因子、IL-7和IL-22等促进胸腺再生[19]。而近年来已证实能重建胸腺功能的方法中除了细胞因子，也可利用转录因子、细胞过继和生物工程等非传统方法有效促进胸腺功能重建与T细胞再生。因此通过多种途径重建胸腺并促进T细胞再生将为临床建立安全、有效的重建免疫治疗提供可靠的理论依据。

[1] Jung WS,Han SM,Kim SM,etal.Stimulatory effect of HGF-overexpressing adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on thymus regeneration in a rat thymus involution model[J].Cell Biol Int,2014,38(10):1106-1117.

[2] Roh KH,Roy K.Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis[J].Biomater Res,2016,20:20.

[3] Kim MJ,Miller CM,Shadrach JL,etal.Young,proliferative thymic epithelial cells engraft and function in aging thymuses[J].J Immunol,2015,194(10):4784-4795.

[4] Tajima A,Liu W,Pradhan I,etal.Promoting 3-D aggregation of FACS purified thymic epithelial cells with EAK 16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel[J].J Vis Exp,2016,doi：10.3791/54062.

[5] Chaudhry MS,Velardi E,Dudakov JA,etal.Thymus:the next (re)generation[J].Immunol Rev,2016,271(1):56-71.

[6] Shen S,Klamer G,Xu N,etal.GSK-3beta inhibition preserves naive T cell phenotype in bone marrow reconstituted mice[J].Exp Hematol,2013,41(12):1016-1027.

[7] Sun X,Xu J,Lu H,etal.Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo[J].Cell Stem Cell,2013,13(2):230-236.

[8] Lai L,Cui C,Jin J,etal.Mouse embryonic stem cell-derived thymic epithelial cell progenitors enhance T-cell reconstitution after allogeneic bone marrow transplantation[J].Blood,2011,118(12):3410-3418.

[9] Tuckett AZ,Thornton RH,O′Reilly RJ,etal.Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency[J].J Hematol Oncol,2017,10(1):109.

[10] Zhang SL,Wang X,Manna S,etal.Chemokine treatment rescues profound T-lineage progenitor homing defect after bone marrow transplant conditioning in mice[J].Blood,2014,124(2):296-304.

[11] Hsieh J,Ng S,Bosinger S,etal.A GMCSF and IL7 fusion cytokine leads to functional thymic-dependent T-cell regeneration in age-associated immune deficiency[J].Clin Transl Immunol,2015,4(5):e37.

[12] Lucas B,James KD,Cosway EJ,etal.Lymphotoxin beta receptor controls t cell progenitor entry to the thymus[J].J Immunol,2016,197(7):2665-2672.

[13] Tormo A,Khodayarian F,Cui Y,etal.Interleukin-21 promotes thymopoiesis recovery following hematopoietic stem cell transplantation[J].J Hematol Oncol,2017,10(1):120.

[14] Bredenkamp N,Nowell CS,Blackburn CC,etal.Regeneration of the aged thymus by a single transcription factor[J].Development，2014,141(8):1627-1637.

[15] Song Y,Su M,Zhu J,etal.FOXN1 recombinant protein enhances T-cell regeneration after hematopoietic stem cell transplantation in mice[J].Eur J Immunol,2016,46(6):1518-1528.

[16] Lopes N,Vachon H,Maire J,etal.Ad ministration of RANKL boosts thymic regeneration upon bone marrow transplantation[J].EMBO Mol Med,2017,9(6):835-851 .

[17] Song Y,Su M,Panchatsharam P,etal.c-Met signalling is required for efficient postnatal thymic regeneration and repair[J].Immunology,2015,144(2):245-253.

[18] Fan Y,Tajima A,Goh SK,etal.Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts[J].Mol Ther,2015,23(7):1262-1277.

[19] Chaudhry MS,Velardi E,Dudakov JA,etal.Thymus:the next (re)generation[J].Immunol Rev,2016,271(1):56-71.