三级淋巴组织在多发性硬化中的研究进展

柴瑞楷 李呼伦

(哈尔滨医科大学神经生物教研室，哈尔滨 150081)

三级淋巴组织(Tertiary lymphoid tissues,TLTs)，也被称为异位淋巴组织，慢性炎症位点通过一种称为淋巴再生的过程形成，TLTs中含有包含生发中心的组织性的B细胞成分，有抗原呈递细胞定位的T细胞区域，它们还包含有可使淋巴细胞从血液进入的高内皮微静脉(High endothelial venule,HEVs)，以及组织上形成的纤维网络。

次级淋巴器官(Secondary lymphoid organ,SLO)包括脾、外周组织淋巴结及黏膜系淋巴结等，SLO的形成需淋巴组织诱导(Lymphoid-tissue inducer,LTi)细胞以及淋巴组织构建细胞(Lymphoid-tissue organizer,LTo)的参与[1]，并且趋化因子[2]和淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)在其构建过程中起着关键作用。CXCL13诱导了LTi细胞募集至淋巴结形成位点，从而起始了淋巴结的形成[3]，而淋巴内皮来源的CCL21也参与了对LTi细胞的吸引，但并非起始淋巴结形成的必要条件[4,5]。淋巴毒素包括LTα、LTβ、LIGHT，其受体为LTβR，表达LTα1β2的LTi细胞募集到位点以后，可以同周围表达LTβR的组织细胞相互作用，导致趋化因子、黏附分子、细胞因子和血管生成因子的产生，将吸引更多的淋巴细胞及树突状细胞(Dendritic cells,DCs)，进一步构建淋巴结。

相比较于SLOs，TLTs存在着异常高表达的趋化因子及炎症因子(Ltαβ、LIGHT、CXCL13、CCL19、BAFF、APRIL)[6,7]，同时发现LTαβ信号刺激下的间质细胞向淋巴构建LTo样的细胞分化，表达Pdpn+[8]。研究也发现，TLTs的发生与维持可能与淋巴管(Lymphatic vessels,LVs)和高内皮微静脉(HEVs)的异常表达有关，HEVs的异常表达使得Naive淋巴细胞的持续进入，造成持续性炎症[9]。LVs的异常生成使得白细胞和DCs的回流发生障碍，从而造成持续性炎症[10]，此外研究者也证明了SLOs中LVs诱导外周耐受，在自身免疫调节子(Autoimmune regulator,AIRE)的控制下表达组织限定性的抗原，且分泌免疫调节因子，它损伤了T细胞的增殖，恶化了免疫反应[11]，而异常表达的LVs是否可调节耐受仍未清楚。

人们发现TLTs微环境具有着SLO的部分功能，它为记忆性Th细胞提供生存的微环境[12]，支持着抗原呈递及B细胞和T细胞的相互作用，促进其进一步分化与成熟。然而，当TLTs在自身抗原不断被呈递到位点处时，也许会促进自身反应性的淋巴细胞激活从而导致组织损伤。在胰腺中形成的TLTs中，研究发现自身抗原在局部被呈递，为自身反应性T细胞的增殖提供了良好的环境，此背景下阻碍TLTs形成会阻止糖尿病的发展[13]；人们发现TLTs也在肺癌中形成，肿瘤相关的TLTs中的调节性T细胞抑制了抗肿瘤T细胞的反应[14]，近年来，Johansson-Percival等[15]利用LIGHT信号，通过血管靶向肽(Vascular targeting peptide,VTP)的作用诱导固体肿瘤中三级淋巴组织生成，有效地抵抗了肿瘤。在此，我们着重介绍TLTs在MS疾病中的一些研究进展。

1 TLTs在MS中的特点

慢性MS患者损伤部位的免疫细胞聚集最初是在1970年被描述的，作者发现淋巴细胞、巨噬细胞以及浆细胞在软组织周围外周空间中同网织细胞相互作用。之后，随着磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)技术的发展，研究更进一步地扩展了我们对于多种亚型MS及疾病不同阶段中皮层损伤的认识，发现皮层损伤很明显同认知损伤及障碍性进展具有联系。近年来的研究发现，在MS患者软脑膜血管周围，存在着独特的炎症浸润，特别是在继发进展型多发性硬化(Secondary progressive multiple sclerosis，SPMS)患者晚期，发现了富集B细胞的免疫细胞的聚集[16]。有趣的是，在MS患者疾病早期阶段尸检研究也发现在脑膜中存在相同的聚集物。在这种背景下，一些研究表明脑膜炎症的发生同皮层脱髓鞘并发具有相关性，其中发现滤泡阳性病例表现为更严重的病程，发病年龄越小，不可逆障碍年龄越小，死亡越早[17]。此外，一个早期MS患者皮层尸检的研究也揭示了中等至明显的脑膜炎症同皮层的脱髓鞘间具有强烈的地域上联系。然而，另一研究并没有发现慢性MS患者脑膜炎症同皮层损伤之间相关的证据，这一切还需进一步研究。

EAE是用于研究MS的动物模型，在不同的EAE模型中，甚至在同一模型中，TLTs具有不均一的特点，提示TLTs的发展和调节是非常复杂的。在MOG35-55(Myelin oligodendroglia glycoprotein)肽段免疫诱导小鼠EAE模型并未发现TLTs，而在另外三种EAE模型中研究者发现了TLTs的存在：MBP-PLP融合蛋白免疫的C57BL/6小鼠模型[18]，视神经脊髓炎EAE模型小鼠[19,20]，C57BL/6背景下的MOG特异性Th17细胞或者SJL背景下的PLP特异性的Th17细胞过继转移小鼠模型[21,22]。

TLTs更倾向于在相关膜处形成，这也许是由于相对于软组织来说，脑膜上存在高密度的血管，这样显示浸润的白细胞进入的重要位置[23]，另一个可能原因是脑膜间质细胞可以提供结构的支持。在一详细的分析中，Pikor等[22]检测到纤维母细胞性的网织细胞(Fibroblastic reticular cell,FRC)样的脑膜纤维母细胞这一部分[表面表达Pdpn，PDGFRα、PDGFRβ和钙黏蛋白且分泌包含纤连蛋白和ERTR7的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分]在CNS炎症期间增加。另外，FRC是次级淋巴器官中吸引T细胞的趋化因子主要来源，而FDC(Follicular dendritic cell)是次级淋巴器官中吸引B细胞趋化因子的主要来源，在MBP-PLP融合蛋白诱导的模型中通过补体受体CD35或FDC-M1标记可以检测到FDC，同FRCs一样，FDCs样的细胞是间质细胞来源且认为它们出现在TLTs中是普遍的局部前体细胞(PDGFRβ+的外周细胞)分化成熟的，而不是从次级淋巴器官迁移过来的结果。而FDCs在自发性的视神经脊髓炎模型和Th17过继转移模型中未能检测到，可能是由于缺乏合适的FDC成熟信号或者缺乏时间导致了一个不完全的分化过程，但鉴于脑膜巨噬细胞显示抗原呈递且在EAE期间重新激活浸润的淋巴细胞，所以有可能其他抗原呈递细胞(Antigen-presenting cell,APCs)在CNS的TLTs中可以代替FDCs。

2 细胞因子在EAE中TLTs的构建上发挥作用

研究表明，表达在LTi细胞表面的异质三联体LTα1β2同间质细胞LTβ受体作用，起始了间质细胞向LTo分化的过程。在小鼠EAE模型中发现，封闭LTβR可以阻止三级淋巴组织的形成，同时降低了EAE的症状[24]。Th17过继免疫模型中发现，LTi细胞和Th17细胞之间也许存在一个共同的祖先，LTi细胞和Th17细胞共同含有一些特点，它们都表达转录调节子RORγt，都可以对IL-23和芳香烃受体的配体起反应，都可以产生IL-17，IL-22和GM-CSF[25]。在SJL鼠背景下，Pikor等[22]展示IL-17和IL-22共同作用在脑膜的FRCs上，诱导了肌动蛋白、胶原蛋白的重构及ECM成分的生成，最终导致纤维网络的形成，为TLTs提供合适的结构。有趣的是，LTβ缺陷的供体鼠分离的Th17细胞过继转移模型中内源性的Th17细胞并未生成，而野生型供体鼠过继转移模型可以看到内源性Th17显著表达，说明LT信号对Th17功能的发挥有着重要作用。同样提示对CNS抗原发生反应的Naïve T细胞诱导和分化也许发生在CNS TLTs中。同时，FRC的重构并不依赖于LT信号，而脑膜FRCs的CXCL13的产生和由此导致的在损伤部位B细胞的聚集及补体的沉淀需要LT信号。同时另一研究发现IL-17可以诱导间质细胞表达CXCL12，IL-22也可上调表皮细胞中CXCL12的表达，CXCL12募集CXCR4+的B细胞，这一途径也许在CNS TLTs的形成中也发挥着作用。在CXCL13-RIP、CCL21-RIP过表达鼠中发现，CXCL13过表达能够诱导出完整的TLTs，而CCL21过表达仅能诱导出部分结构[26,27]，猜测CXCR5+B细胞同TLTs功能的发挥也可能存在联系。

3 B细胞在淋巴组织中的作用及在MS/EAE中的研究进展

B细胞对淋巴器官的形成起着重要的作用。B细胞来源的细胞因子，包括淋巴毒素，对次级淋巴器官的个体发育、稳态和激活是重要的，同样对异位点的TLTs发展是重要的。在许多例子中，B细胞通过供应LTα1β2在淋巴器官生成中发挥作用，这些细胞因子介导的功能在获得性免疫中很重要，因为当B细胞表达LTα1β2缺陷时，生发中心缺乏，B细胞的记忆会损伤，再次体液免疫会降低[28]。在RORγt缺陷(LTi缺陷)小鼠中，通过口服控制糖酐酯钠诱导的结肠炎模型中，淋巴组织的形成可能是由于B细胞通过LTα1β2驱动的而不是依赖于LTi细胞，结肠上大量三级淋巴组织的发展需要B细胞提供的LTα1β2[29]。TLTs同样出现在流感病毒感染的LTi细胞缺陷的小鼠肺部，猜测这一过程可能存在B细胞的参与。B细胞同LTi细胞都表达CXCR5和LTα1β2，也许这些重叠功能导致这一情况产生。

CXCL13在TLTs构建是重要的，CXCL13可以诱导B细胞聚集，之后在胰腺B细胞过表达CXCL13转基因鼠中发现，CXCL13也许还刺激了浸润的B细胞LTα1β2的表达，随后甚至在不存在炎症的时候也能诱导淋巴组织形成所需要的局部间质的重构。研究发现β细胞转基因过表达IL-4或IL-6也导致胰腺中B细胞的聚集，但并没有诱导局部淋巴器官生成[30]。

B细胞可以刺激淋巴结的生长。在淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒感染(Lymphocytic choriomeni-ngitis virus,LCMV)中，引流淋巴结体积增加近3倍，B细胞通过提供LTα1β2控制这一扩增。在B细胞缺陷鼠中，LTi细胞聚集到次级淋巴器官，但并不能刺激淋巴结的生长[31]；孤立淋巴滤泡(Isolated lymphoid follicles,ILFs)大小同内部的B细胞相关。未成熟的ILFs几乎没有B细胞，而成熟的ILFs含有组织很好的B细胞滤泡，ILFs从未成熟到成熟状态的转变依赖于B细胞来源的LTα1β2。在这一背景下，LTα1β2是被Naïve B和激活的旁B细胞提供的，因为这一过程既没有B细胞受体(B-cell antigen receptor,BCR)的参与，T细胞也不是必须的[32]。

在大多MS病例中，寡克隆带(Oligoclonal banding,OCBs)的形成是患者高特异性的，这一特点常用于临床MS患者的鉴定。之后，研究发现利妥昔单克隆抗体(Rituximab)删除B细胞治疗可以显著缓解MS疾病的严重程度以及延缓疾病的复发，之后针对B细胞进行了深入的研究，发现B细胞也可以分泌促炎性和抑炎性的细胞因子[33]，对疾病的发生发展起着重要的免疫调节作用，其中一些研究也描述了B细胞参与中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中TLTs的发展。

在所有EAE模型中，B细胞的聚集被认为CNS中TLTs的界定标准，相对来说，T细胞似乎是散状分布的，而不是成簇的，它被检测到围绕着B细胞区域，而在B细胞区域内偶尔发现个别T细胞。相对于B细胞，T细胞也许很少依赖结构和聚集来发挥它们的效应。进一步发现，似乎对形成单独的T细胞区域起反应的趋化因子(CCL19和CCL21)在CNS中并未强烈表达，而组织B细胞区域的趋化因子CXCL13在一些EAE模型中已被检测到，同样CXCL12也在标准EAE模型中被检测到。研究也发现在脑膜下B细胞滤泡中检测到RORγt阳性和CD3阴性的细胞，这些细胞也许代表着第三类先天性免疫细胞，它们包含着LTi细胞亚群，有可能参与TLTs的形成。据观察，一些B细胞聚集物中具有CD35+FDCs形成的复杂的网状网络的特点。滤泡中的B细胞同发展的FDC网络的聚集物显示了成群的Ki67阳性[34]，猜测是生发中心的形成，也许支持着特异性T细胞和B细胞的激活。

4 总结与讨论

总的来说，脑膜是一个易于建立一个炎症小生境的CNS环境，它能够支持CNS中的免疫反应。脑膜免疫细胞的聚集重现了淋巴滤泡样的特点，因此，对B、T细胞的相互作用提供了良好的微环境，从而支持了局部B细胞和T细胞的激活和进一步成熟。脑膜TLTs中主要存在B细胞聚集物，B细胞LTα1β2信号起始了TLTs的形成，T细胞一般不依赖于聚集发挥效应，同时研究发现CD20 单克隆抗体治疗小鼠EAE模型中脑膜内B细胞明显降低，而软组织中B细胞并无变化[35,36]，我们猜测存在于脑膜上的B细胞应对疾病的进展发挥着作用，更进一步猜测这群致脑炎性B细胞是否是通过建立TLTs这一途径来发挥作用。同时是否还会存在这样一个疾病发生机制——当人脑受到持续性病毒感染时，一方面导致脑膜TLTs生成，另一方面损伤神经细胞，导致大量神经髓鞘抗原出现，容易使淋巴调控发生障碍的TLTs识别自身抗原，导致大量自身免疫性细胞的出现，从而成为自身免疫性疾病。如果这些猜想能被证明的话，人们便可以将TLTs作为有效的预防与治疗靶点来改善疾病。

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