外泌体及其对调节性T细胞作用的研究进展①

张少鹏 倪绪皓 吕 凌

(南京医科大学第一附属医院,南京 210029)

CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞)与B细胞，效应T细胞，Th1和Th17等免疫细胞相比，同等细胞数的CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞分泌的外泌体的量要明显多于上述其他免疫细胞[1]。于此同时，Treg细胞对树突状和肿瘤等细胞所分泌的外泌体的敏感程度要比其他亚型的T细胞如CD4+和CD8+效应T细胞高[2]。本文将重点讲述多种细胞起源的外泌体和多种疾病状态下外泌体对Treg细胞分化与增殖的影响，以及Treg细胞起源的外泌体对其自身发挥免疫调节能力的影响。

1 外泌体

1981年首次发现外泌体在绵羊网织红细胞[3]，特指直径在30～100 nm，密度范围1.13～1.19 g/ml的盘状囊泡，多种细胞在生理及病理状态下均可分泌外泌体[4]。CD63、CD9、CD81和MHCⅡ等分子是大部分外泌体的共同表面标志物[5]。

1.1外泌体的形成 脑型大鼠肉瘤(Rat sarcoma，Ras)相关蛋白家族中的多种蛋白通过调控不同的步骤，对外泌体的形成过程至关重要。Rab11 和Rab35 通过循环利用胞内体参与细胞的内吞过程，Rab27a/27b同时参与终末胞内体的形成[6]。其中Rab27a作用于SYTL4(Synaptotag min-like 4) 而Rab27b作用于 EXPH5(Exophilin 5),两者通过作用于不同靶点调控外泌体形成过程中不同的环节[7]。与此同时有研究表明ESCRT(Endosomal sorting complex required for transport)复合物0、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在诱导多泡体(Multivesicular body,MVB)内陷形成囊泡进而被分泌到细胞外的过程中起到重要作用[8]。

髓磷脂和淋巴细胞蛋白(Myelin and lymphocyte protein，MAL)是一种四次跨膜蛋白，有研究者发现MAL蛋白具有调节T细胞分泌外泌体的作用。在MAL敲低的情况下，T细胞分泌外泌体的功能明显受到限制，该实验选择荧光标记CD63和CD9分子来跟踪外泌体分泌过程，通过实时电镜观察发现当MAL缺乏时，大量的CD63分子积聚在细胞内，进一步研究发现胞质内的外泌体前体无法顺利与细胞膜融合，该结果表明蛋白MAL通过介导外泌体与细胞膜的融合在T细胞外泌体的形成过程中扮演着非常关键的角色[9]。

1.2外泌体的作用机制及功能 外泌体的作用机制目前还存在争议，其中有三种说法受到较为广泛的认可：①外泌体可以同时与靶细胞表面的多种受体结合，进而激活细胞内的信号通路。②外泌体可以结合到靶细胞膜表面成为该细胞新的表面分子，进而促进该细胞识别其他信号分子。③外泌体可与细胞膜相融合，释放囊泡内的蛋白质、mRNA以及微小RNA等分子物质到靶细胞中发挥调节作用[4]。

文中还提及，外泌体早先被认为是细胞排解胞内废弃物的一种方式，如一部分已经不具有利用价值的膜蛋白，后又有研究者认为外泌体的分泌还有一个功能：将胞内一部分蛋白酶无法分解的蛋白分子转运出去。如今研究集中在外泌体如何通过囊泡内包含的物质(尤其是微小RNA等小分子物质)作用于靶细胞，介导细胞与细胞之间非直接接触途径，从而进行细胞间的相互交流与作用。

2 不同细胞起源的外泌体对Treg细胞的影响

不同细胞来源的外泌体通过不同的机制，对促炎因子IL-1β、TNF-β和抑炎因子TGF-β、IL-10等细胞因子，CD39、CD73、CTLA-4等蛋白分子水平进行调节，从而对调节性T细胞的诱导发育，增殖及发挥免疫抑制能力有着不同的影响，下面重点讲述树突状细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等起源的外泌体对调节性T细胞的影响。

2.1树突状细胞起源的外泌体 树突状细胞(Dendritic cell,DC)可以通过提高IL-2的水平，进而促进Treg细胞的增殖。同时还有研究发现，当未成熟树突状细胞起源的外泌体(immature dendritic cell derived exosome,imDex)在体外与Treg细胞共培养时，imDex可以促进Treg细胞的增殖。为了探究体内imDex对Treg细胞功能的影响，该研究联用imDex和Treg细胞处理移植小鼠模型，结果表明该方法能够降低小鼠对移植物的炎性排斥水平，且联用供体来源imDex和具有供体抗原特异性Treg细胞抑制效果最佳[10]。由此，我们猜测imDex是否在促进Treg细胞增殖的同时，还可以增强Treg细胞诱导免疫耐受的功能，从而减缓免疫排斥的反应。

2.2间充质干细胞起源外泌体 健康人骨髓中提取的间充质干细胞可以分泌一定量的外泌体，研究发现间充质干细胞起源外泌体(Mesenchymal stromal cells-derived exosome,MSCex)具有调节多种免疫因子的作用，一方面可以抑制IL-1β和TNF-β等促炎症因子的分泌，另一方面也能够提高抗炎因子TGF-β的分泌。同时MSCex还可以促进效应T细胞向Treg细胞转化，提高Treg细胞的比例，并提高Treg细胞中CTLA-4的表达水平。这与之前研究发现MSCex可以诱导效应T细胞凋亡并促进Treg细胞增殖的结果一致[11]。MSCex提高TGF-β表达水平很可能与其增加Treg细胞数量存在密切联系。然而CTLA-4在MSCex发挥免疫抑制效应与增加Treg细胞比例的调节过程中是否发挥重要作用还需要进一步证实。

2.3肿瘤细胞 研究表明肿瘤细胞起源的外泌体(Tumor derived exosomes,Tex)包含多种对免疫细胞有抑制功能的生物分子，同时可以诱导效应T细胞转化为Treg细胞，并促进Treg细胞的扩增。Muller等[2]分离出源自头颈部鳞状细胞癌的外泌体，并观察其对Treg细胞在RNA和蛋白质水平的影响。结果显示Tex对处于静态和激活状态的Treg细胞起到不同的作用，静态Treg细胞又称幼稚Treg细胞，分布于次级淋巴器官和循环，功能低下；激活的Treg细胞又称活动的Treg细胞，只占分布于次级淋巴器官和循环中的Treg细胞的小部分，但是功能强大，可有力地调节免疫系统平衡[12]。当Tex与Treg细胞共培养16 h后，处于静息状态的Treg细胞(CD62LhiCCR7+或CD45RAhiCD25low，resting Treg细胞)中IL-10,和COX-2的mRNA水平有明显的提高，表达CD39和CD73的mRNA水平则显著下降。而激活状态的Treg细胞(CD45RAlowCD25hi或CD62LlowCCR7lowCD44hiKLRG1+CD103+，activated Treg cell)对Tex的敏感性要比其他T细胞亚型高，分析显示：除了表达IL-10和COX-2的mRNA，表达CD25(IL-2R)、CD39、CD73和CD26 的mRNA水平也显著上升。此研究还发现了一个有趣的现象，虽然静息状态的Treg细胞与Tex共培养后CD39和CD73的mRNA水平下调，但是CD39和CD73蛋白的表达水平却明显提高，具体的机制尚不清楚。对于Tex的作用机制，作者通过利用PKH26染色剂(带有较长脂质尾巴的黄色-橙色荧光染料，可以结合到细胞膜脂质区域上，用于监测外来病毒、血小板和其他纳米颗粒如外泌体的摄入)对Tex进行标记发现Treg细胞并没有内摄Tex，表明Tex对Treg细胞的作用方式很可能是通过与细胞表面受体的识别进而对胞内的生物分子进行调控的。

鼻咽癌细胞起源的外泌体(Nasopharyngeal carcinoma derived exosom，NPCex)对Treg细胞在肿瘤微环境中的异常集聚具有重要调控作用[13]。鼻咽癌细胞分泌的外泌体既能够促进Treg细胞的动员，也能促使CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25highTreg细胞，同时还能够诱导Treg细胞的扩增。研究还发现鼻咽癌细胞中C15细胞系表达多种Treg细胞趋化因子，其中CCL-20的含量最高，当C15细胞系起源的外泌体加入到Treg细胞中，CCL-20受体基因6(CCL20-receptor gene 6,CCR6)在Treg细胞中的表达量会有所提高。与此同时，加入抗CCL20抗体会减弱C15细胞起源外泌体促进Treg细胞集聚的调节作用，所以CCL-20被认为是NPCex调控Treg细胞的重要因子。同时，李伟等[14]发现在小鼠皮肤移植模型中，CCL-20联合Treg细胞可以显著延长异体皮肤存活时间，且CCL-20可能与趋化Treg细胞大量向肝脏定植相关。因此，深入了解NPCex对Treg细胞影响的同时也许对如何缓解肝移植术后患者的免疫排斥反应具有重大指导意义。

还有研究发现，肺癌细胞起源的miRNA-214可以促进Treg细胞的扩增，同时提高Treg细胞内IL-10的水平，而miRNA-214很可能是依赖外泌体途径发挥作用的[15]。前面提到Tex包含多种对免疫细胞具有抑制功能的生物分子，同时可以增强Treg细胞的免疫负调节功能。由此猜测肿瘤细胞很有可能通过外泌体向包括Treg细胞在内的多种免疫细胞转运肿瘤特异性分子，参与抑制免疫细胞抗肿瘤反应，介导肿瘤细胞的免疫逃逸。

同时我们猜测，疾病状态下细胞起源的外泌体可以发挥多种作用。如高表达吲哚胺双氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)的树突状细胞起源的外泌体能够抑制小鼠胶原所诱导的关节炎疾病(Collagen-induced arthritis,CIA)的发生，并能够在一定程度上缓解已发生的关节炎的症状，同时该外泌体对小鼠迟发型超敏反应(Delayed type hypersensitivity,DTH)的发生也有一定的抑制作用。而且研究者发现外泌体对上述免疫疾病的抑制作用甚至要比分泌该外泌体的树突状细胞本身还要强[16]。

值得注意的是，该现象与外泌体促进Treg细胞的激活与增殖有关，其中毒性T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)在此过程中扮演了重要的角色。CTLA4-Ig和CD80/86具有高亲和力，结合后可以上调树突状细胞吲哚胺双氧酶含量，并增强细胞的免疫抑制能力[17-19]。

3 调节性T细胞起源的外泌体的作用

外泌体被发现以来，多种免疫细胞被发现具有分泌外泌体的功能，但是Treg细胞在2013年才首次被证实具有分泌外泌体的功能[20]。有研究指出Treg细胞所分泌外泌体的数量受多种因素调节，包括细胞内的Ca2+浓度，低氧，神经酰脂鞘磷脂综合体和IL-2含量等[1]。

Treg细胞起源的外泌体对Treg细胞本身发挥免疫调节作用非常关键。如果抑制Treg细胞外泌体的释放，那么其对免疫细胞如效应T细胞的抑制能力将被削弱。Rab27是外泌体分泌过程中必不可少的，研究发现Rab27-DKO Treg细胞失去分泌外泌体的功能后无法预防部分自身免疫疾病发生，最终导致严重的系统性炎症疾病，同时炎症因子IFN-γ的水平有所上升[21]。体外实验还证明Treg细胞起源的外泌体能够有效抑制T细胞的增殖，而且外泌体剂量高时抑制能力更强[22]。更值得注意的是，该研究还发现注射Treg细胞起源的外泌体可以显著延长肾移植后小鼠的存活期，其中延长时间最长的是注射供体来源的Treg细胞外泌体，该结果提示Treg细胞起源的外泌体具有和Treg细胞相类似的作用。Treg细胞起源外泌体的作用机制目前还不明确，但很大程度上与其所包含的小分子物质有关。Treg细胞起源外泌体包含CD73、CD25和CTLA-4等分子，有研究还指出CD73分子在外泌体发挥功能的过程中起到关键作用，CD73分子缺失的Treg细胞起源外泌体的免疫抑制能力减弱，这很可能与CD73介导的腺苷酸通路有关，在调节性T细胞中，CD39和CD73共同介导的腺苷通路可以通过产生腺苷，降低细胞外三磷酸腺苷(ATP)等方式对效应T细胞等免疫细胞产生强大的抑制作用。腺苷酸与其受体A2aR结合，进而抑制T细胞的免疫反应与炎症因子的产生[23]。

同时，还有研究发现多种miRNA参与Treg细胞起源外泌体的免疫调节过程。该研究发现，Treg细胞中的miRNA-155、Let-7d、Let-7b和miRNA前体(Hp-miR-344d-2)可以被T细胞摄入，而且是通过非细胞直接接触的外泌体途径，Rab27-KO的Treg细胞无法将RNA转入T细胞内。外泌体中的miRNA-155可以提高IFN-γ和IFN-α的分泌，促进Th1细胞的免疫反应。与此相反，Let-7d与介导Treg细胞抑制Th1细胞的效应密切相关。研究者发现，Th1细胞经Let-7d抑制剂处理后，可以减弱Treg细胞本身对Th1细胞的抑制作用，而Treg细胞起源的外泌体在处理后则完全失去对Th1细胞的抑制作用。该研究还发现，环氧化物酶-2(Cox-2)可能是Let-7d介导抑制效应的潜在作用靶点[1]。

虽然Treg细胞起源外泌体具有与Treg细胞相类似的作用，但是它的抑制能力要比Treg细胞本身弱[1]，由此推断外泌体仅仅是Treg细胞发挥免疫抑制效应的一种途径，Treg细胞通过外泌体途径对其高效发挥免疫调节作用进行补充，而并非起到决定性的作用。

4 总结与展望

外泌体自被发现以来，其在细胞通讯中的作用广受关注,人们对外泌体的分泌机制和作用机制也有了初步的了解。越来越多的研究表明外泌体在介导细胞相互作用尤其是间接作用中扮演了极其重要的角色，外泌体是Treg细胞发挥生物功能不可或缺的组成部分，外泌体和细胞直接接触两种途径相结合对Treg细胞最大效益发挥其免疫效应至关重要。Treg细胞起源外泌体被证实具有重要的免疫抑制作用，但是其具体机制尚不完全清楚，例如 Treg细胞起源外泌体中虽然只有miRNA-155、Let-7d、Let-7b等可以被Th1细胞摄入并发挥促进或抑制的作用[1]，但是外泌体也可以通过与靶细胞表面受体相结合进而发挥作用，所以外泌体中包含的其他小分子物质是否可以通过非摄入的方式发挥调节作用需要进一步的研究。另外如何提取高纯度的外泌体以及其发挥作用的最佳浓度是多少？为什么供体来源的外泌体对受体免疫排斥反应的抑制作用更强？不同亚型的Treg细胞所分泌的外泌体之间是否存在差异，这种差异是否影响其自身分化增殖过程？这些都有待于研究者们继续艰苦奋斗，寻求真知。同时也希望本综述能为接下来的探索提供一些线索与思路。

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