磷脂酰果糖的合成方法研究

刘峻屹，刘炎峻，李兆杰，徐 杰，王静凤，毛相朝，薛长湖(中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

磷脂包括多种具有大分子多样性的化合物，如磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)等[1-2]，其在多个方面发挥多效性，如炎症、囊泡运输、内吞作用、细胞周期和衰老、存活和细胞凋亡和细胞应激反应[3-4]。磷脂具有相当广泛的工业应用，在食品工业中可以作为乳化剂、稳定剂、抗氧化剂[5]。磷脂的这些化学和物理性质，正是依赖于其特殊的分子结构，磷脂含有特定的极性基团和脂肪酸[6]。磷脂结构的修饰，无论是通过化学方法还是通过酶法已经进行了几十年，并且进行了各种不同的应用。前者广泛被研究，应用于膜物理性能的改善[7-8]，后者通过磷脂酶D(PLD)进行的转酯反应[9-10]。对酶转酯反应的研究大多为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油的合成[11]。这些通过酶改性的磷脂通常具有抗癌、抗氧化等特殊的功效。比如磷脂酰丝氨酸，经研究表明，其与脑功能作用相关，并且在改善记忆力、提高认知、治疗阿尔茨海默病、治疗抑郁症等方面发挥着重要的作用[12]。

2006年，一种新的磷脂酰糖苷，磷脂酰β-D-糖苷(PtdGlc)，从胎鼠脑的脂筏上被检测出来。PtdGlc 由饱和脂肪酰基链(C18∶0和C20∶0)以及糖苷极性头部组成，富集存在于小鼠等动物大脑皮层的星形胶质细胞系细胞中，与神经胶质细胞-神经元的信号系统相关[13]。磷脂酰果糖是磷脂酰糖苷的一种，其在封装和运输物质等方面有很好的应用前景，如在脂质体的应用。但脂质体的稳定性不好，如果在冷冻干燥的过程中，将糖加入到脂质体中，能够有效增强脂质体结构的稳定性[14]。另外，磷脂酰果糖也可应用于靶向药物或功能性成分的传递。但磷脂酰果糖在体内含量较少，其合成制备方法非常有限。目前，我们旨在开发一个水相体系，以大豆卵磷脂、果糖为原料，磷脂酶D为催化剂，通过磷脂酶D催化酶法高效合成磷脂酰果糖的方法，对基质配比、pH、反应温度、反应时间等进行调控，建立磷脂酰果糖的最佳合成条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

大豆卵磷脂(磷脂含量90%)，上海源叶生物有限公司；磷脂酶D，德固赛(中国)公司；乙醚、醋酸、盐酸、甲醇、氯仿、氯化钙、无水乙酸钠，均为分析纯；果糖，上海源叶生物有限公司；正己烷(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)和甲醇(色谱纯)，德国Merck 公司；甲酸(色谱纯)，天津市光复精细化工研究所。

1.1.2 仪器与设备

Laborota 4000型旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；AB135-S型精密电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MS 3型旋涡混匀器，德国IKA公司；超声波清洗机；SHA-B型水浴摇床；100系列高效液相色谱仪，G6410B三重四极杆质谱仪，配大气压化学电离源(ESI)，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 磷脂酰果糖的制备

将果糖(949.87 mg)和含氯化钙的醋酸-醋酸钠缓冲液(1 mL)放在20 mL血清瓶中，在60℃烘箱中预先加热，加入一定量的PLD使其与果糖及缓冲液在血清瓶中充分溶解；另取一个20 mL血清瓶，加入大豆卵磷脂(100 mg)和无水乙醚(1 mL)充分振荡摇匀，然后将二者充分混合，在恒温振荡培养箱中充分振荡，在一定反应温度下，180 r/min反应一段时间后取出样品，加入1 mol/L的盐酸灭酶活，停止反应，取一定量的反应混合物加入2倍体积的氯仿- 甲醇(体积比2∶1)中，混匀后，静置分层，取下层检测。

1.2.2 高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS-MS)分析

通过HPLC-MS-MS对磷脂酰果糖进行分析。

色谱条件：Ascentis Si HPLC Pore column色谱柱(15 cm×1.0 mm，3 μm)，流速1 mL/min；进样量0.5 mL/min，进样体积5 μL；流动相A为正己烷-异丙醇(体积比70∶30)，0.5%甲酸，0.08%氨水；B为异丙醇-水(体积比100∶13)，0.5%甲酸，0.2%氨水；梯度洗脱程序见表1。质谱条件：负电喷雾离子化(ESI)；一级质谱扫描范围(m/z)600～1 000；二级质谱扫描范围(m/z)50～1 000；毛细管电压4 000 V；喷雾气压275.8 kPa；干燥氮气流速9.0 L/min；气体温度350℃。

表1 梯度洗脱程序

1.2.3 磷脂酰果糖的纯化

采用LC-Si柱进行脂质组分的分离纯化。取上述反应得到的10 mg磷脂酰果糖样品溶于 0.2 mL 氯仿中，待上柱。将LC-Si依次用适量的甲醇、氯仿溶液进行洗脱，活化LC-Si柱，待硅胶柱呈现透明状，说明柱子已活化完全。待样品上柱后依次用10 mL氯仿，5 mL氯仿-甲醇(体积比 9∶1)，3 mL氯仿-甲醇(体积比2∶1)，5 mL氯仿-甲醇(体积比1∶2)，5 mL甲醇洗脱，分别进行收集。3 mL 氯仿-甲醇(体积比2∶1)，5 mL氯仿-甲醇(体积比 1∶2)部分，即为所得样品。

2 结果与讨论

2.1 HPLC-MS-MS检测磷脂酰果糖

大豆卵磷脂的转酯反应通常是由有机相和水相两种体系组成的[1]。在研究中，充分利用生物酶的催化具有高选择性的作用，采用PLD在醋酸-醋酸钠缓冲液的系统中催化大豆卵磷脂和果糖的转酯反应。图1为磷脂酰果糖的总离子流图和母离子扫描质谱图。

由图1可知，在负离子模式下，磷脂酰果糖的出峰时间在6～8 min，提取磷脂酰果糖峰进行分析，可以看到不同质荷比(m/z)的磷脂酰果糖，对磷脂酰果糖的二级质谱进行分析，其中，2个主要的峰m/z833.52和857.51，代表2种不同脂肪酸组成的磷脂酰果糖。

图1 负离子模式下磷脂酰果糖的总离子流图(a)和母离子扫描质谱图(b)

2.2 底物摩尔比对磷脂酰果糖合成的影响

底物(果糖与大豆卵磷脂)摩尔比会影响水解反应与转磷脂酰反应的竞争，从而影响磷脂酰果糖的合成率。在反应温度40℃、pH 6、反应时间12 h、酶添加量90 U/mL条件下，考察底物摩尔比对磷脂酰果糖合成的影响，结果见图2。

图2 底物摩尔比对磷脂酰果糖合成率的影响

由图2可知，随着底物摩尔比的增大，磷脂酰果糖的合成率逐渐提高；底物摩尔比为1∶45时，磷脂酰果糖的合成率达到最高，为89%；此后，底物摩尔比继续增大，磷脂酰果糖合成率几乎不变。因此，适宜的底物摩尔比为1∶45。

2.3 pH对磷脂酰果糖合成的影响

缓冲液pH是影响PLD活性的重要因素。在底物摩尔比1∶45、其他条件不变条件下，考察pH对磷脂酰果糖合成的影响，结果见图3。

由图3可知，在强酸性的环境下磷脂酰果糖的合成率几乎为0，这可能是由于酸性较大破坏了PLD的分子结构，从而影响了酶的活性；当pH为6时磷脂酰果糖的合成率较高，达88.9%。继续增大pH时，水解反应竞争逐渐增大，磷脂酰果糖的合成率下降。因此，选择pH为6较适宜。

图3 pH对磷脂酰果糖合成率的影响

2.4 反应时间对磷脂酰果糖合成的影响

在底物摩尔比1∶45、pH 6、其他条件不变条件下，考察反应时间对磷脂酰果糖合成的影响，结果见图4。

图4 反应时间对磷脂酰果糖合成率的影响

由图4可知，反应前12 h内，磷脂酰果糖合成率随着反应时间的延长逐渐提高，超过12 h后，磷脂酰果糖的合成率逐渐减少，可能是反应时间过长，磷脂酰果糖发生了水解。因此，在12 h左右，反应已经达到平衡，可以选择此时停止反应。

2.5 反应温度对磷脂酰果糖合成的影响

反应温度是影响酶解反应的一个重要参数，适宜的反应温度不但可以提高反应速度，还有助于延长酶的使用寿命和影响反应平衡。在pH 6、底物摩尔比1∶45、反应时间12 h、其他条件不变条件下，考察反应温度对磷脂酰果糖合成的影响，结果见图5。

图5 反应温度对磷脂酰果糖合成率的影响

由图5可知，PLD在40℃达到较高的酶活反应效率，在50℃以上酶失活，磷脂酰果糖合成率显著降低。因此，较适宜的反应温度选择40℃。

2.6 酶添加量对磷脂酰果糖合成的影响

在pH为6、底物摩尔比1∶45、反应温度40℃、反应时间12 h的条件下，考察酶添加量对磷脂酰果糖合成的影响，结果见图6。

图6 酶添加量对磷脂酰果糖合成率的影响

由图6可知，磷脂酰果糖的合成率在一定范围内随着酶添加量的增加而增加，当酶添加量超过90 U/mL 后，酶添加量对磷脂酰果糖的合成率影响不明显。这是因为当酶添加量达到一定程度时，能够给底物提供足够的活性中心供底物反应，再增加酶添加量将不会影响反应的平衡。因此，较适宜的酶添加量为90 U/mL。

综上所述，我们可以得到水相体系中PLD催化酶法合成磷脂酰糖苷的方法。通过对基质配比、pH、反应温度、反应时间等的调控，建立了磷脂酰果糖的最佳合成条件为：反应温度40℃，pH 6，反应时间12 h，底物摩尔比1∶45，酶添加量90 U/mL。在最佳合成条件下，磷脂酰果糖合成率在90%左右。

3 结 论

以大豆卵磷脂和果糖为原料，采用磷脂酶D(PLD)催化合成新型磷脂酰果糖。在反应温度40℃、pH 6、反应时间12 h、底物(果糖与大豆卵磷脂)摩尔比1∶45、酶添加量90 U/mL条件下，磷脂酰果糖合成率在90%左右。本合成方法具有简单、安全、无污染，在反应过程中无有害物质产生等优点。

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