棘球蚴(包虫)病预防疫苗的研制与应用

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我国有两种类型的棘球蚴病(包虫病)，即囊型棘球蚴病(CE)和泡型棘球蚴病(AE)。囊型棘球蚴病由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus，Eg)引起，泡型棘球蚴病由多房棘球绦虫(E.multilocularis，Em)引起。棘球蚴病控制的长期性和复杂性决定了其控制措施应是简便，经济和有效的。通过免疫预防手段切断病原循环链是控制研究的方向，其应用将大大缩短控制进程[1-2]。20世纪80年代以前，人们对寄生虫病的免疫预防研究多持谨慎态度，防治重点是在药物防治方面，有效的药物治疗在寄生虫病的防治中起到了十分重要的作用。但近年来，由于经典的抗寄生虫药(如氯喹、氯苯胍等)对一些寄生虫病的治疗作用不断减弱，有些地区(如在非洲)几乎失去使用价值。耐药风险的增加使人们又重新将目光转移到免疫学预防方面。然而，蠕虫由于其长期的适应和进化，产生了一系列的逃避机制，加大了疫苗研制的难度。但随着免疫学、细胞生物学、分子生物学等新技术的应用，抗寄生虫虫苗的研究也取得了长足进展。

1 抗细粒棘球绦虫疫苗研制的策略

如果通过免疫接种的方式切断棘球蚴病原循环链，无论是消除中间宿主的中绦期，还是终末宿主的成虫，或是阻断虫卵的产生，都可以控制棘球蚴病的传播。长期的控制实践表明，只有控制技术的突破，才能迅速控制包虫病。免疫接种犬和绵羊等宿主，将省去高频度对犬驱虫的高投入和困难，加快控制进程。另外，从宿主的数量上讲，犬的数量要比家畜的数量少几倍或几十倍，免疫接种犬，是一种理想化的棘球蚴病控制手段[3]。

在疫苗研制的策略方面，由于中绦期幼虫和成虫在宿主体内寄生部位的不同，对抗原的筛选和诱导产生的保护性反应也不同。细粒棘球绦虫的中绦期即包囊寄生在中间宿主的实质性器官中，抗原诱导的反应应以诱导系统免疫为主；而成虫寄生在终末宿主的小肠内，所诱导的免疫反应应以诱导局部的肠道粘膜免疫反应为主。

同许多传染病的感染途径一样，棘球蚴病也是“病从口入”。中间宿主食入绦虫虫卵后，在胃液胃蛋白酶和小肠胰蛋白酶的作用下脱去卵壳，并激活六钩蚴，六钩蚴分泌蛋白酶(穿刺酶)[4]并借助自身的收缩变形运动，使其“破肠壁，进血流”，这个过程是设计中间宿主抗虫疫苗的重要考虑因素。诱导特异的肠道粘膜免疫反应，阻止六钩蚴“破肠壁，进血流”，和定居应是疫苗研制的思路。

孵化后的六钩蚴可以在很短的时间内定居于靶器官，主要是肝脏和肺脏，通过免疫接种诱导的免疫反应杀灭和抑制幼虫是疫苗设计的思路。一般认为多细胞蠕虫病原体长期的进化和演变使其与宿主产生了共生的关系，很难通过免疫接种的途径消除病原体。但研究表明，通过疫苗接种，抑制寄生虫的生长发育，固着，生殖，运动和其对营养物质的吸收是疫苗研制的突破口。中绦期疫苗研制的靶基因应当是六钩蚴定居，包囊生长和营养代谢有关的基因；成虫期的靶基因应当是与营养物质的吸收，神经，生殖，固着和运动有关的基因[5]。对保护抗原筛选，目前主要采取以下几种途经：用感染血清筛选病原体抗原；根据已知保护性抗原，克隆同源蛋白抗原；根据蛋白在病原体发育的重要性定向并有目的地筛选病原体抗原。

2 中间宿主接种疫苗的研制

对带科绦虫中间宿主抗感染的免疫生物学研究推动了疫苗学的研究和发展。最早采用的方法是对抗再感染能力的评估，主要是依据伴随免疫的特点。中间宿主初次感染带科绦虫幼虫后，可以激发伴随免疫，并可以抵抗再次感染。通过感染中间宿主，分离血清，用血清筛选六钩蚴抗原或表达基因库，已成功找到几种抗带科绦虫，例如大鼠寄生的巨颈绦虫(Taeniataeniaeformis)，兔体内寄生的豆状带绦虫(T.pisiformis)，牛体内的牛带绦虫(T.saginata)和羊体内的泡状带绦虫(T.hydatigena)幼虫的保护性抗原[6-8]。羊是细粒棘球绦虫最适合的中间宿主。研究表明，一旦羊感染细粒棘球蚴可以产生很高的抗二次感染的能力。

用带科绦虫提取物作为抗原接种中间宿主可以产生非常高的免疫保护。Gemmell首次证明，用激活的六钩蚴或细粒棘球绦虫虫卵的提取物免疫羊，然后对口服虫卵的攻击，可获得高的免疫效果，减少90%的包囊生长率。两次或多次接种六钩蚴抗原，绵羊可产生完全的保护。用六钩蚴体外培养物免疫羔羊两次，可以获得类似的保护水平[9]。

这些研究清楚地表明，六钩蚴或其分泌物，是保护性抗原的重要来源，这些抗原可引起体内完全的或近完全的的保护效果。为寻找六钩蚴有效的保护性抗原，Heath和Lawrence用不同方法分离细粒棘球绦虫六钩蚴抗原，然后免疫羊，获得了抗血清。再将这些血清用于免疫印迹，并通过六钩蚴体外杀伤检测，确定了细粒棘球绦虫六钩蚴不同组份蛋白的免疫力。用六钩蚴提取物免疫绵羊后，进行攻击感染实验，获得的抗血清，能够杀死体外培养的六钩蚴。在免疫印迹试验中，血清能与23-25 kDa的六钩蚴抗原成分发生明显的抗原抗体反应，也能使机体产生抗六钩蚴的免疫保护效果[10]。

用抗23-25 kDa抗原的抗血清筛选六钩蚴cDNA文库，获得了一个克隆，EG95。通过亚克隆构建到表达载体上重组EG95-GST融合蛋白，接种绵羊取得了很高的保护率[11]。EG95疫苗已经在新西兰，澳大利亚，阿根廷，中国和智利地区进行了试验，其保护率在96%～100%[12-13]。用EG95免疫袋鼠，无论是在一个月或者九个月后，进行攻击感染实验，EG95都显示出很高的保护效果，与绵羊体内获得的保护效果(96%～100%)相类似[14]。目前EG95已经在我国大面积推广使用，用于棘球蚴病的控制。

目前，随着各种生物学新技术，尤其是分子生物学技术在寄生虫学研究领域的应用，寄生虫免疫学研究也不断取得进展，在澳大利亚利用基因工程技术可以规模化生产牛巴贝斯虫基因工程苗，人用恶性疟原虫基因工程苗已在坦桑尼亚等非洲国家试用了多年，并取得了令人振奋的临床保护效果。抗绦蚴病重组蛋白疫苗，其中包括用于羊接种的抗羊带绦虫(Taeniaovis)病、用于牛接种的抗牛囊虫(牛带绦虫，T.sagatina)病、用于猪接种的抗猪囊虫(猪带绦虫，T.solium)病的疫苗取得重大进展[15]。这些疫苗都是从绦虫的六钩蚴(虫卵)分离的蛋白，经基因的克隆，表达载体的亚克隆，在大肠杆菌或酵母菌中表达；再经蛋白的纯化，与适当的佐剂配伍后，制备出重组疫苗。带科绦虫的六钩蚴抗原可以诱导中间宿主产生保护性免疫可能是一个共性，已经成为疫苗研制中抗原筛选的方向。

根据EG95的基因序列，从E.multilocularis分离同源基因(EM95)与EG95有80%的等同序列。EM95与GST融合蛋白在大肠杆菌中表达和纯化后，接种小鼠，然后口服多房棘球绦虫虫卵，结果表明使小鼠产生了83%的抗感染保护率[16]。

3 终末宿主疫苗的研制

细粒棘球绦虫的成虫寄生在犬科动物的小肠内，成熟后向体外随粪便排出大量的虫卵，使人和其它中间宿主感染致病。因此，虫卵是原发性棘球蚴病感染的真正病原体。犬是细粒棘球绦虫最主要的终末宿主，在流行病学中具有重要意义，对棘球蚴病的传播流行起着关键的作用。控制研究表明，通过在成虫成熟期前驱虫，阻断成虫向环境中排放虫卵，以切断病源的传播，可以控制该病的流行[17]。如果用免疫接种的方法达到减少细粒棘球绦虫在犬体内的荷虫数或阻止虫卵的产生将极大简化控制措施，加快棘球蚴病的控制进程。在我国采取 “犬犬投药，月月驱虫”的无虫卵污染驱虫措施，可以阻断病原的传播[17]。但高频度的驱虫在牧区的执行有很大的困难，若能对犬实施免疫接种预防，可以极大程度减少防控的工作量，加快包虫病的控制。

在上世纪60到80年代，由新西兰，澳大利亚和前苏联的科学家在犬抗细粒棘球绦虫方面，尤其是在抗原的筛选方面进行了研究。Gemmell给犬接种成虫和原头蚴抗原，证明可使犬产生部分保护[3]。犬经过反复感染(最多八次)原头蚴可以提高抗感染能力，并且发现原头蚴生长被阻止，发育迟缓。给犬口服感染被辐射过的原头蚴，其生长发育也受到阻碍。最近在不同高发流行国家和地区的流行病学调查表明，老龄犬的荷虫数远比幼犬体内的荷虫数低。说明犬产生了获得性免疫保护，而使其荷虫数降低[18]。

从寄生生物学上讲，细粒棘球绦虫在犬小肠中的寄生有其独有的特点。该绦虫的头节深埋于肠粘膜系统的Lieberk?hn小体，常常导致肠表皮细胞的损伤，说明发育中的细粒棘球绦虫与犬肠粘膜上皮组织有着紧密的结合，为此，该成虫也被称之为“组织蠕虫”。由于这种紧密的结合，使得虫体抗原可以进入犬体肠道细胞内并被系统免疫和局部免疫系统所识别，激发一系列的抗虫免疫[3]。

另外，哺乳动物的肠腔内可以发生一系列的免疫反应，比如上皮M细胞产生分泌型的免疫球蛋白IgA (sIgA)，粘膜肥大细胞(MMC)分泌白三烯和幼虫移行抑制复合物，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性等，这些反应在抗虫免疫中都起到重要的作用。

4 重组蛋白疫苗

重组技术是疫苗生产上的一个重大技术突破，但到目前为止，仅有少数几个蛋白分子用于疫苗评估。Zhang等用差异显示PCR(Differential display PCR)技术获得了3个基因 (EgM4，EgM9 和EgM123)，属于一种新的EgM蛋白家族。EgM家族基因仅在Eg成熟成虫(MAWs)阶段表达，可能参与成虫的成熟和卵的发育[19]。用大肠杆菌表达EgM9和EgM123并接种犬，感染45 d后进行剖检，可诱导犬产生95%的减虫免疫保护[20]。Chabalgoity 等将Eg的脂肪酸结合蛋白(FABP)连接到鼠伤寒沙门(氏)菌减活菌株LVR01的aroC上，通过口服接种犬，结果显示这一疫苗有很强的耐受性，并检测到了特异性抗体及细胞应答[21]。将表达的Em基因片段(II/3-10)编码种属特异性抗原的鼠伤寒沙门(氏)菌LT2 M1C中免疫犬，在免疫早期也可得到相似的结果；通过皮下接种的方式将这个重组疫苗接种犬也会诱发强的体液免疫和淋巴细胞增殖[22]。用成虫的两种重组蛋白—原肌球蛋白 (EgTrp) 和纤维状蛋白 (EgA31)制成犬用口服疫苗，通过口服免疫使犬对抵抗Eg成虫产生保护，犬的荷虫数减少了70%～80%，并且虫体发育受阻[23]。

5 研制犬疫苗的挑战和机遇

保护性抗原的筛选是研制犬抗虫疫苗的当务之急。细粒棘球绦虫是一个多细胞寄生虫，只有采取多抗原多位点的攻击，才能取得保护，而疫苗的效应应该是减少原头蚴的转化和在肠粘膜的固着以及阻止虫体的发育。

终末宿主是吞食了包虫囊内的原头蚴，在其胃肠道组织液的作用下，原头蚴经过外翻，变形蠕动，并且可能通过体表的蛋白肽感受体，找到小肠适当的位置定居，而寄生的部位是肠内蛋白肽最多的部位。绦虫通过吸盘的吸附作用和头钩的锚定作用，固定在肠粘膜的利比昆小体的凹槽内。疫苗研制的策略可以通过抗体封闭虫体表面的蛋白肽受体和蛋白肽趋化感受器，使虫体不能在蛋白肽富集的小肠部位寄生，这样虫体便不会很好地发育或直接被排除体外以减少虫体的数量。犬对细粒棘球绦虫感染不仅可以产生很强的肠道粘膜免疫反应，而且可以引起体液免疫[24-26]。试验表明犬血清中含有虫体抗原的抗体时，不易感染[24]。补体的杀伤和裂解也可能是重要的保护机制之一[27-28]，但长期以来，免疫因子与抗虫保护的关系没有定论。研究表明[23-24,29]，血清IgG，肠道粘膜IgA，Th2 和Th1 淋巴因子与荷虫量没有相关性[26]。但由于试验所用的犬数太少，而无法确定这些免疫因子与保护的关系。

犬免疫研制停滞的另一个原因是保护性抗原筛选的缺乏。随着分子生物学的不断发展，尤其是最近发表的Eg，Em和其它几个蠕虫的基因组和虫体不同发育阶段的转录组，不仅使我们对Eg的生物学有了更深的了解，同时使我们掌握了一批研制抗成虫感染的候选基因[5,30]。另外，由于人们对肠道粘膜免疫的深入了解，使得研制抗肠道寄生虫疫苗成为可能。

通过感染和化药驱虫[31]建立了抗感染模型[32]，证明Eg感染可以使犬产生强的Th2极性反应。两轮感染和驱虫治疗后，犬产生了抗虫免疫，虫体的数量明显减少，Th2免疫反应向Th1发展，说明Th1反应与抗性有关。IL-10，TGF-beta与荷虫量没有关系[32]。

目前还没有一种用于接种犬科动物的疫苗预防棘球绦虫的感染。由于包虫病防控的长期性，对犬免疫接种的研究是必须的。从接种量和经济的角度考虑，犬接种将远远低于对中间宿主的接种。使用适当的佐剂来改进疫苗也是今后研究的方向。细菌表达产物、来自于植物中的天然化合物以及微粒给药系统是目前被广泛研究的疫苗载体，并且有可能作为粘膜佐剂。Carol等用Eg原头蚴的皮层抗原和ISCOMS以滴鼻的方式免疫犬，在唾液中检测到了引起的粘膜IgA应答，在外周血中特异分泌IgA的细胞也增加了10-20倍[29]。虽然没有更深入的报道，这种方法作为犬科动物宿主Eg和Em疫苗的递药系统可以作为进一步的研究方向。将细粒棘球绦虫疫苗做成食饵喂犬是一种非常适当的方法，如果能与减活的鼠伤寒沙门(氏)菌一起进行口服免疫将是一种切实可行的途径。在疫区应用同样的方法，组合的狂犬病/包虫病口服疫苗将会使包虫病疫苗更便于应用。自然感染的犬已被免疫，是否免疫接种可以加强免疫使犬产生更有效的保护还不清楚，有待于进一步验证。同样，感染其它绦虫例如泡状带绦虫是否会影响疫苗的功效，重复的使用驱虫剂是否会加强接种疫苗的效果也同样没有任何数据。如果研制疫苗的方向是抑制虫卵的产生，那么疫苗接种后探明虫体在肠道的存活和虫卵的发生是至关重要的。

研制有效犬科动物Em疫苗目前还没有进展，并且还不清楚原型Eg犬疫苗是否会提供一种交叉保护作用。控制Em野生动物传播循环，在多数地区都是非常困难的，尤其是狐狸分布广泛。然而在一些AE疫区，家犬在AE的传播染中扮演着很重要的角色。接种犬预防泡球蚴病感染人群是今后泡球蚴防控研究方向。

6 结 语

犬是Eg最主要的终末宿主，在包虫病的传播中起到关键作用，调查证明我国人、畜包虫病基本来源于犬。在我国西北农牧区，犬是家畜数量的四十分之一，所以对犬实行免疫预防具有实用性。包虫病控制是一项长期的工作，其长期性表现为两个方面：一是实际控制需要20～30年，二是控制后需要一个巩固期，一般在岛屿国家或地区需要10～20年，内陆国家或地区将需要更长时间，疫苗的研制是包虫病控制的发展方向。