lncRNA在猪上的研究进展

冯韶华 曹洪战芦春莲

（河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000）

2002年，Okazaki等[1]在对小鼠测序过程中最早发现了长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）。最初，研究者认为lncRNA是非编码RNA，不具有任何作用，仅仅是转录中的副产物，没有生物学功能。而后随着大量lncRNA被发现，人们逐渐改变了对lncRNA的认识，它不仅在转录前、转录中和转录后参与各基因组的转录活动，还影响一些蛋白质的编码活动。因此，当前对lncRNA的研究进入了火热的阶段。

1 lncRNA简述

具有调节作用的非编码RNA分为lncRNA和短链非编码RNA，lncRNA的核酸长度大于200 nt。哺乳动物中50%的DNA能转录成RNA，RNA中仅有1%～2%能够被转录为蛋白质编码RNA，其余的则会被转录为非编码RNA，因此研究非编码RNA的功能和机制有助于加快动物或植物的遗传进展。根据lncRNA在基因组中与蛋白质编码基因的相对位置，将其分为5类：正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因内lncRNA和基因间lncRNA[2]。lncRNA是一类功能性RNA分子，位于细胞核或细胞质内，以RNA形式在多种层面（如表观遗传学、转录调控及转录后调控等）调控基因的表达水平[3]。自lncRNA被发现以来，其研究热度一直在持续。

2 lncRNA的研究方法

目前，lncRNA的研究方法已逐渐成熟，研究者不断探索新的方法对lncRNA进行深入研究，尤其在人类疾病研究中取得了较大的进展，当前已建立了许多相关的lncRNA数据库。筛选lncRNA的研究方法主要有2种：⑴高通量测序，通过测序不仅能够获得lncRNA，也会获得其他转录产物，高通量测序最有可能发现新的转录产物；⑵lncRNA芯片，目前芯片检测主要用于人类疾病相关lncRNA的初筛。对lncRNA功能的研究方法主要有4种：⑴RNA干扰（RNA interference,RNAi），通过在细胞中特异性敲除相关lncRNA来检测其功能作用，当lncRNA定位于细胞质时可采用此方法；⑵荧光定量逆转录—聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR），它可以检测低拷贝数的RNA，具有较高的灵敏性；⑶实时荧光定量PCR（RT-qPCR），一般又可分为2类，一类为染料类，一类为探针类；⑷荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization），其优点是安全且灵敏度高。此外，对lncRNA机制的研究方法有RNA免疫沉淀技术（RNA immunoprecipi-tation,RIP），此方法可以研究与RNA结合的蛋白质的功能作用。

研究lncRNA的主要步骤分3步：⑴高通量测序以分析差异表达的lncRNA，基于RNA-seq技术对不同的动物组织进行测序，通过对结果的分析检验是否存在差异表达的lncRNA；⑵验证测序结果并进行定位，测序后的结果可以通过相关网站比对，例如NONCODE等，确定所测序的基因序列及其所在位置；⑶确定功能，最后对lncRNA进一步研究，可通过建立lncRNA表达载体或沉默lncRNA的方法进行功能分析。

3 猪遗传育种方面对lncRNA的研究

3.1 lncRNA在猪胚胎上的研究

胚胎发育是一个复杂的过程，胚胎发育后细胞进而分化为不同的组织或器官，最后发育为完整的个体。相关研究表明lncRNA可以影响猪的胚胎活动。2013年，Han等[4]对猪胚胎和胎盘中H19的表达进行了研究，发现孤雌胎儿和胎盘与正常受精卵中表达的H19不同。2016年，Li等[5]对猪受精卵植入前胚胎发育过程中的lincRNA进行了基因鉴定和分析，发现许多lncRNA与细胞周期的调控、转录和代谢活动有关，并能够调节受精卵的基因活动。2016年李竞宇[6]对猪早期胚胎的lncRNA进行了全面分析，发现其中有2个高表达的lncRNA对猪的胚胎发育有一定的影响。

3.2 lncRNA在猪繁殖上的研究

繁殖性状是猪重要的经济性状，受到许多研究者和工作者的重视，通过深入研究繁殖性状相关基因或蛋白质的关系，可以为猪的育种工作提供理论基础，进而有效提高猪的繁殖力。2011年，Anna等[7]对伊比利亚猪和大白猪的睾丸进行了转录组分析，发现了一部分lncRNA的转录本和转座子的组成；同时发现大白猪和伊比利亚猪参与精子发生和脂代谢的基因差异较大，说明大白猪和伊比利亚猪2个品种在繁殖力和脂肪沉积方面的表型差异一致。2016年，Ran等[8]对猪出生后30 d和180 d的未成熟和成熟的睾丸组织进行分析，发现这2个时间点之间存在许多差异，包括生精小管和间质结缔组织的直径，以及生精细胞和支持细胞的数量，然后对基因组进行测序，共检测到了101个差异表达的lncRNA。2017年，Wang等[9]分析猪子宫内膜在妊娠和非妊娠时期的lncRNA和cRNA，结果表明2组间37个mRNA、34个lncRNA和1个miRNA差异显著，进一步进行功能分析，发现这些RNA参与了细胞粘附、结合、核酸代谢等多种生物学过程。2017年，Weng等[10]对猪的睾丸发育过程进行了lncRNA鉴定，发现lncRNA的靶基因参与调控睾丸发育和精子发生的代谢途径。

3.3 lncRNA在猪肉质上的研究

越来越多的消费者注重肉质的口感，肉质性状作为猪的主要遗传性状，其遗传力水平相对偏低，因此，需要分子辅助标记对肉质性状进行辅助选育，进而改善肉质。2014年，Zhou等[11,12]对93个猪样本进行RNA-seq，首次对猪lincRNA进行全面的分析；同时，对猪脂肪和肌肉中lincRNA的甲基化模式进行了研究，结果发现检测到的某些lincRNA在猪脂肪和肌肉中表现出不同程度的甲基化，这为以后lincRNA在肉质中的进一步研究提供了理论支持。2017年，Liu等[13]对瘦肉型猪（杜洛克猪）和肥胖型猪（陆川猪）进行了lncRNA表达谱的分析，结果证明lncRNA在脂肪沉积中起调控作用。2017年，Sun等[14]使用 RNA-Seq和 miRNA-Seq检测了长白猪和蓝塘猪背最长肌中蛋白质编码转录本和非编码RNA的表达谱，发现了547个差异表达基因，这给不同肌纤维在不同品种间的发育提供了分子研究的参考依据。

3.4 lncRNA在其他方面的研究

lncRNA不仅可以调控动植物的生殖细胞，还可对猪的肌内脂肪造成一定影响，同时也对猪的某些疾病产生影响。2016年，Xia等[15]对高能量饮食诱导的非酒精脂肪性肝炎（NASH）小型猪的lncRNA进行分析，发现lncRNA可以影响NASH，多种差异表达的lncRNA可调控NASH相关靶蛋白编码基因。2017年，Xing等分析淮南雄性猪肌肉中lncRNA对睾酮缺乏症的影响时，发现lncRNA及其靶基因参与了睾酮缺乏症相关的骨骼肌生长的调控。2018年，Yu等研究了lncRNA MEG3在骨骼肌发育中的影响，结果发现猪骨骼肌中MEG3序列较为保守，且会参与猪早期骨骼肌的分化和维持。2018年，Che等对猪脾脏相关lncRNA进行了研究，发现了不同发育阶段的脾脏相关lncRNA具有较大的差异，这为研究动物脾脏的分子机制提供了基础。

4 展望

目前关于lncRNA的研究大多还处于探索阶段，lncRNA真正的作用机制还不明确，而且lncRNA在猪上的研究还较少，关于猪lncRNA的数据库还不完善。ALDB（The domestic animal lncRNA database） 数据库是针对家畜lncRNA所建立的，该数据库可以为研究家畜的lncRNA提供参考。

未来如何研究猪lncRNA的调控机制，通过同一个体的不同部位或者不同个体之间的相同部位进行研究，仍需要研究者进一步的探索。当前，运用测序手段可以了解更多的未知lncRNA，进而为猪肌肉组织性状、繁殖性状等的研究提供理论依据。猪作为重要的家畜，不论在肉质性状还是遗传性状方面对其lncRNA的研究都具有重要的意义，未来lncRNA在猪育种领域的研究中会是新的热点。随着对lncRNA的深入研究，其作用机制也会更广泛地被人们所熟知。