阴沟肠杆菌AcrAB-TolC外排系统基因的相关性研究

张丽琴，管海宁，肖作淼，刘聪，肖九长

阴沟肠杆菌是一种常见的条件致病菌，可导致伤口、呼吸道、泌尿道的严重感染，且多为医院内感染[1]。由于临床广泛地使用广谱抗菌药物治疗阴沟肠杆菌引起的感染，导致阴沟肠杆菌检出及对常用抗菌药物的耐药性逐年上升，造成耐药问题日益严重[2]。阴沟肠杆菌的耐药机制多而复杂，关于主动外排系统的研究较少，为了解AcrABTolC外排系统在赣南地区临床分离阴沟肠杆菌中的携带情况及介导耐药性形成中的作用，我们对AcrAB-TolC外排系统的 acrA，acrB，acrR和 tolC四种基因进行了检测，并对其与阴沟肠杆菌耐药性的关系进行了研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集赣南地区三所三甲综合医院2015年1月至2015年6月从呼吸道、泌尿道、伤口等临床标本中分离的阴沟肠杆菌共136株，剔除同一患者相同部位分离的重复菌株，所有菌株经Vitek 2 compact全自动微生物鉴定药敏分析系统进行鉴定和药敏。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.2 主要仪器及试剂 法国梅里埃公司生产的Vitek 2 compact全自动微生物鉴定药敏分析系统及配套的GN、AST-GN16卡；PCR扩增仪为德国艾本德公司产品；琼脂糖凝胶电泳仪为美国博乐公司产品；凝胶成像系统为法国VILBER公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Taq DNA Polymerase cat.No.：B500010（内含：10×buffer、Mg2+、Taq DNA Polymerase） 和 dNTP购自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的PCR检测 细菌DNA的提取严格按照试剂盒说明书进行。将已提取的阴沟肠杆菌DNA进行PCR扩增。所用引物由上海生工合成，详见表1。PCR反应体系均为20μl：10×buffer 2.0μl，Mg2+（25mM）1.2μl，dNTP（2.5mM）1.6μl，Taq DNA Polymerase （5U/μl）0.5μl， 上 、 下 游 引 物（10μM） 各 1.0μl，DNA 模板 2.0μl，ddH2O 10.7μl。反 应 条 件 ：acrA 基 因 ：95℃ ，5min→（95℃ ，30s+60℃，30s+72℃，30s)×30 循 环→72℃，10min；acrB基因：95℃，5min→（95℃，30s+60℃，30s+72℃，30s)×30 循 环→72℃，10min；acrR 基 因 ：94℃，4min→（95℃，30s+48℃，30s+72℃，1min)×30 循环→72℃，10min；tolC 基 因 ：95℃ ，5min→（95℃ ，30s+60℃ ，30s+72℃，30s)×30 循环→72℃，10min。 反应结束后取5μl PCR扩增产物经含Goldview I型核酸染色剂的2%琼脂糖凝胶电泳40min，使用凝胶成像系统观察拍照。将PCR阳性产物送上海生工测序，在基因库中比对分析。

1.3.2 统计学分析 使用WHONET 5.6和SPSS 15.0统计软件进行数据分析，耐药率的组间比较采用u检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 目的基因的引物序列和产物长度

2 结果

2.1 阴沟肠杆菌的药敏结果 136株阴沟肠杆菌对头孢曲松的耐药率高达52.2%，氨曲南、复方新诺明、环丙沙星、庆大霉素等抗菌药物的耐药率均在30%以上，亚胺培南的耐药率已高达15.4%，未出现替加环素耐药株。

2.2 目的基因的检测结果 136株阴沟肠杆菌中，tolC、acrR、acrA及 acrB基因的检出率分别为95.6%、80.9%、70.6%和61.7%，其中tolC基因检出率显著高于其它三种基因。同时携带四种基因的菌株最多，占36.8%（50/136）。部分菌株四种基因PCR产物电泳图见图1。基因测序结果在NCBI基因库中比对分析显示，acrA基因序列与登录号AM287286阴沟肠杆菌的同源性为98%；acrB基因序列与登录号AM287287阴沟肠杆菌的同源性为99%；tolC基因序列与登录号AM287288阴沟肠杆菌的同源性为98%；acrR基因序列与登录号EF627524阴沟肠杆菌的同源性为99%。

图1 部分阴沟肠杆菌四种基因的PCR扩增结果电泳图

2.3 外排系统基因与常用抗菌药物耐药之间的关系 根据外排系统基因的携带进行分组比较136株阴沟肠杆菌对四类常用抗菌药物的耐药率。分组情况为：四种基因全（+）组与 acrA（+）acrB（-）tolC（+）acrR（+）组、acrA（+）与 acrA（-）组、acrB（+）与 acrB（-）组、tolC（+）与 tolC（-）组、acrR（+）与acrR（-）组。 统计结果显示：4(+)组和 3(+)组比较 P=0.771>0.05，无统计学意义；各外排系统基因阳性组的耐药率均高于相应外排系统基因阴性组 （P<0.01），有显著统计学意义，见表2。

3 讨论

2014年和2015年全国细菌耐药监测报告阴沟肠杆菌在革兰阴性菌分离中排第五位，是医院感染的重要病原菌。本实验136株阴沟肠杆菌药敏结果显示，临床使用最广泛的三代头孢菌素的耐药率高达50%以上，特别是作为治疗肠杆菌科细菌最佳药物的碳青霉烯耐药率已高达15.4%，提示多重耐药甚至泛耐药的阴沟肠杆菌在赣南地区的检出不在少数，且耐药问题不容乐观。

阴沟肠杆菌耐药机制复杂，产β-内酰胺酶是其主要耐药机制，但在细菌多重耐药性产生过程中主动外排系统也发挥了重要作用[3-5]。AcrAB-TolC外排系统隶属于主动外排系统的耐药结节分化超家族。该系统广泛存在于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌等肠杆菌科细菌中，它可主动将进入菌体内的抗生素泵出，使药物浓度下降难以发挥抗菌作用而出现耐药[6，7]。 acrA，acrB，tolC 和acrR四种基因存在于染色体上，可编码AcrABTolC外排系统[8]。

表2 根据基因携带分组比较四类常用抗菌药物的耐药率（%）

本研究显示，acrA，acrB，tolC和acrR四种基因的携带率均在60%以上，其中tolC基因的检出率最高，acrB基因的检出率最低，说明AcrAB-TolC外排系统基因在阴沟肠杆菌中普遍且差异性的存在；另外，此次分离的阴沟肠杆菌不但在药敏结果上与别的地区之间有所差异，而且基因携带方面tolC基因的检出最为显著，也异于其它文献报道[9]。一方面可能与地域差别有关，另一方面可能与各地区各医院之间临床抗菌药物的使用习惯有关。胡小行等报道[10]外排系统在阴沟肠杆菌敏感株和耐药株中均存在，但对耐药株的影响大于敏感株。文中通过分组比较耐药率的结果显示各外排系统基因阳性组的耐药率均高于相应外排系统基因阴性组 （P<0.01），说明AcrAB-TolC外排系统在阴沟肠杆菌的耐药形成中发挥了重要的作用；4(+)组和3(+)组比较无统计学意义反映AcrAB-TolC外排系统的各种基因可能存在联合作用。文献报道AcrAB-TolC外排系统基因高表达表现出对多种常用抗菌药物包括β内酰胺类、甲氧苄啶、喹诺酮等耐药[11-13]。尽管此次未在基因表达上进行更深入研究，但对AcrAB-TolC外排系统基因分布及耐药相关性问题有了深刻的认识。另外，在碳青霉烯类耐药的多重耐药阴沟肠杆菌中，也可能存在其它耐药机制（高产AmpC酶、ESBLs、碳青霉烯酶等）的协同作用[14，15]，造成了阴沟肠杆菌高水平的耐药现象，其具体的基因型仍需进一步有针对性地研究。综上所述，AcrAB-TolC外排系统在阴沟肠杆菌耐药形成中具有不可忽视的作用，加强阴沟肠杆菌耐药机制的基础研究，可为寻求防治阴沟肠杆菌耐药途径提供依据。