新余市甲型流感病毒M基因进化及金刚烷胺类耐药性分析

付倩 ，文奇 ，周银古 ，刘琴 ，宋利军 ，熊英 ，李建雄

流感病毒属于正黏病毒科的单负链RNA病毒，按照核蛋白抗原的不同可分为甲、乙、丙三型，其中以甲型流感病毒危害最大，曾经引起至少4起世界流感大流行[1]。甲型流感病毒基因组由8个节段组成，其中第7个节段为M基因，编码M蛋白。M蛋白是除血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)外第3种跨膜蛋白[2]，可分为M1、M2蛋白，分别在稳定病毒包膜机构、构成离子通道功能方面发挥重要作用。本文通过对新余市2013年-2015年甲型流感病毒M基因进行测序分析，获取甲型流感病毒M基因进化以及烷胺类药物耐药性等信息。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集流感监测哨点医院流感样病例和疑似流感暴发疫情病例的咽拭子标本。

1.2 病毒分离 采用狗肾传代细胞（MDCK）进行病毒分离，根据细胞病变和微量血凝试验（HA）来判断病毒是否存在，将HA≥1：8的标本采用血凝抑制试验 （HAI）进行流感病毒型别鉴定，MDCK细胞、标准抗血清分别由江西省疾控中心、国家流感中心提供。

1.3 毒株选择 随机选择新余市2013年-2015年分离到的甲型流感毒株，进行基因扩增和测序，其中新型H1N1病毒14株、H3N2病毒16株，所有毒株均经国家流感中心复核鉴定。

1.4 RNA提取 按照QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒（Cat.No：74106，Lot No：145022097）操作说明书，从流感毒株中提取病毒核酸。

1.5 M基因扩增 采用QIAGEN公司的One Step RT-PCR Kit 试 剂 盒 (Cat.No：210212，Lot No：145030642)进行RT-PCR反应，引物及反应条件[3]：F1：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCA GGTAG-3′，R1027：5′-CAGGAAACAGCTATGACC AGTAGMAACAAGGTAGT-3′， 逆转录 60℃ 1min，42℃ 10min，50℃ 30min；热启动 95℃ 15min；循环94℃ 40s，50℃ 40s，72℃ 1min，35 次 ； 保 温 72℃10min，在BIO-RAD PTC-200仪器上进行扩增。

1.6 序列测定和分析 RT-PCR产物交于上海生工生物工程技术服务有限公司纯化和双向测序。序列分析利用DNAstar中Seqman软件对双向序列进行拼接、MegAlign软件进行同源性分析，以及Mega5.0中 Clustal W 方法进行序列比对、Neighbor-joining法构建进化树。选取烷胺类药物敏感株A/NewYork/55/2004（H3N2）以及 2010 年～2015 年北半球疫苗推荐株 A/California/07/2009(H1N1)、2012年～2014年北半球疫苗推荐株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、2014年～2015年北半球疫苗推荐株A/Texas/50/2012(H3N2)作为参考毒株，从GenBank下载M基因序列，收录号分别为CY121126、CY121681、KJ942681、KC892961。

2 结果

2.1 M基因核苷酸序列进化分析 30株甲型流感病毒的M基因双向序列经拼接均获得长度约为1000bp的核苷酸序列，对其构建进化树（图1），M基因核苷酸序列进化树分为H3N2和新型H1N1二大分支。H3N2大分支上，烷胺类药物敏感株A/NewYork/55/2004（H3N2）为一分支，16 株 H3N2 病毒与 疫 苗株 A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)构成另一分支；新型H1N1大分支上，14株新型H1N1病毒形成一个分支，疫苗株A/California/07/2009(H1N1)为另一分支。16株H3N2病毒与药物敏感株 A/NewYork/55/2004（H3N2）、疫苗 株 A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)相比较，核苷酸序列相似性分别在97.8%～98.2%、99.6%～100%、99.4%～99.8%；14 株新 H1N1病毒与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比较，相似性为 98.4%～99.2%；16 株 H3N2 病毒之间、14株新型 H1N1病毒之间相似性分别为 99.2%～100%、98.8%～100%。

图1 M基因核苷酸序列进化树

2.2 M2蛋白氨基酸序列分析 M2基因核苷酸编码序列为M基因前26bp和中后部268bp的组合序列，由核苷酸序列推导出M2蛋白氨基酸序列（图2），它由97个氨基酸所组成。与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比较，14株新型 H1N1病毒均发生D21G突变，A/JiangxiYushui/SWL1220/2014(H1)存在另一个突变T65M；与烷胺类药物敏感株 A/NewYork/55/2004（H3N2）相比较，疫苗株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)和新余市分离的16株H3N2病毒均存在S31N、N88D替换；与疫苗株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)相比较，除了 A/JiangxiYushui/1100/2014(H3)发生V28A突变、A/JiangxiFenyi/515/2014(H3)发生 Y52H和 G89N突变、A/JiangxiYushui/525/2015(H3)发生 G89N突变外，新余市其它13株H3N2病毒均未发生变异。

2.3 烷胺类药物耐药性位点分析 与烷胺类药物敏感株A/NewYork/55/2004（H3N2）相比较，疫苗株A/California/07/2009 (H1N1)、A/Vitoria/361/2011(H3N2)、A/Texas/50/2012(H3N2)和 新 余 30 株 甲 型流感病毒均发生了S31N的氨基酸替换。

图2 M2基因氨基酸序列位点分析

3 讨论

疫苗是预防流感最有效的方法，但疫苗的有效性必须与流行株相匹配[6]。而新疫苗的研制总是滞后于流感的流行，因此抗病毒药物成为应对流感的必要手段。烷胺类药物是最早投入使用的抗流感药物，如金刚烷胺和金刚乙胺[10-12]。M2蛋白位于流感病毒包膜上，结构上分为胞外区、跨膜区和胞浆区，其中跨膜区通过二硫键使其N’端第25～43位氨基酸形成管状四聚体 （离子出入通道），在流感病毒感染过程中发挥着重要作用：一是随着病毒在胞饮过程中形成内涵体，M2蛋白被激活开放离子通道，氢离子内流导致病毒内酸化，使病毒核酸与病毒衣壳的结合减弱而易于进入宿主细胞；二是在病毒脱出宿主细胞时保护病毒HA蛋白构象不发生因适酸化引起的不可逆变化，有利于病毒颗粒的装配、释放[7]。烷胺类药物与M2蛋白离子通道结合，抑制离子通道阻断氢离子内流，从而抑制病毒复制。流感病毒极易对烷胺类药物产生耐药突变，耐药株的产生与M2蛋白上构成通道离子的氨基酸位点改变有关，现已证实L26F、V27A、A30T、S31N、G34E位中的氨基酸只要有1个或1个以上的变异就会导致耐药株的出现[8]。从烷胺类药物上市以来就不断有流感耐药株的报道，美国疾病预防控制中心（CDC）在1992年至2005年间分离的H3N2流感病毒中具有烷胺类药物抗性的比例从0.3%急剧上升至92.3%，而全球分离到的烷胺类抗性毒株98%以上都携带S31N突变，且随后在2008年至2009年流感的监测报告中公布了3000多株流感毒株药敏试验结果，其中季节性H3N2和新H1N1对烷胺类耐药率已达到100%[9]。国内学者对1989年-2005年中国分离到的H3N2毒株抽样后进行耐药性检测，结果表明1989年-1999年未检测到烷胺类药物抗性毒株，2000年之后耐药比例逐渐上升，至2005年已经达到77.6%[4]。在江西省内部分地区流感病毒耐药性情况已见报道[13-15]，但有关新余市流感病毒的耐药性研究此前尚未展开。分析新余市流感病毒M基因进化情况，推导出M2蛋白氨基酸序列，就可以了解新余当地流行株是否产生耐药性突变。

分析新余市2013年至2015年甲型流感病毒M基因进化情况可以发现，30株流行株与相应的疫苗推荐株高度同源但M基因仍不断进化，变异程度随时间跨度有缓慢增加的趋势。从M2蛋白97个氨基酸位点变异来看，与相应的疫苗株相比较，16株H3N2病毒中除了A/JiangxiYushui/1100/2014 (H3)、A/JiangxiFenyi/515/2014(H3)、A/Jiangxi Yushui/525/2015(H3)这3株涉及1～2个位点突变外，其余13株病毒均未发生变异，较稳定，而14株新H1N1病毒均发生1～2个氨基酸替换；M2蛋白跨膜区第25～43位氨基酸是烷胺类药物的作用靶位，对影响烷胺类药物敏感的26、27、30、31和34位氨基酸进行分析[4]。新余市30株甲型流感病毒M2蛋白跨膜区第31位氨基酸均由丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)，与江西省南昌市的监测结果相同[3，5]；，全部对烷胺类药物产生耐药，烷胺类药物已经不能作为流感的预防和治疗用药，建议对流感病毒耐药性问题加以重视。