缺血缺氧性脑损伤后细胞凋亡通路及针康法干预作用的研究进展*

刘 波，刘 颖，陈明星，景 伟，杨圆圆，唐 强

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

缺血缺氧性脑损伤(HIBD)是由新生儿在围产期发生缺血缺氧导致的疾病。是引起中枢神经损伤和新生儿死亡的主要原因。HIBD的发病率约为每1 000例新生儿有1至3例，在中国每年受该病影响的婴儿多达4万～5万名[1]。临床上表现为运动障碍或各种严重的神经系统后遗症，如脑瘫、癫痫或严重的智力缺陷等[2]。目前认为，细胞凋亡是导致缺血缺氧性脑损伤后神经系统发生损伤及缺血半暗区正常神经细胞死亡的重要机制[3]。因此，阻止缺血缺氧性脑损伤后相关神经元的细胞凋亡对降低HIBD的致残率和死亡率尤其重要[4]。有众多文献报道称针康法可以通过减少和抑制细胞凋亡来促进缺血缺氧性脑损伤后神经功能的恢复。本研究就对缺血缺氧性脑损伤后细胞凋亡通路及针康法干预作用的相关研究做出如下概述。

1 细胞凋亡内源性通路

在脑组织发生缺血缺氧性损伤后，细胞可因内部凋亡因子的刺激，激活细胞内源性的凋亡途径，造成细胞凋亡[5]。线粒体作为细胞内重要物质，其在细胞凋亡过程中担任重要角色，细胞凋亡的内源性途径依赖于线粒体外膜透化(MOMP)，其对细胞凋亡起调控作用。当神经细胞受损时，改变了线粒体的通透性，激活了细胞内的Cyt C、Bcl-2、第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂(Smac/DIABLO)、凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(EndoG)等许多促细胞凋亡蛋白，使其在胞浆中释放[6]。并借Caspase依赖性凋亡通路和非Caspase依赖性凋亡通路调控细胞凋亡。

1.1 Caspase依赖性凋亡通路

在细胞凋亡的途径中，胞浆中释放的全细胞色素C在细胞凋亡过程中起重要的作用。全细胞色素C作为参与机体氧化过程的电子传递体，构成呼吸链并可提高细胞呼吸中氧的利用率。当机体发生缺血缺氧性损伤时，全细胞色素C被释放。凋亡小体和下游执行者半胱天冬酶，特别是Caspase-3，在缺氧缺血性损伤后被激活，导致细胞凋亡。在拥有能量来源(三磷酸腺苷)的情况下，一方面，全细胞色素C借助三磷酸腺苷(ATP)发挥的作用与接头蛋白Apaf-1结合。使活化的接头蛋白Apaf-1与释放的全细胞色素C及起始凋亡蛋白酶caspase-9(一种促凋亡蛋白酶)三者形成凋亡小体[7]。凋亡小体发挥作用，使被激活的caspase-7及与之相关的蛋白裂解，并激活其他caspase，最终导致细胞凋亡。另一方面，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂(Smac/DIABLO)阻止已被激活的caspase-9与IAP结合，促进caspase的活性，进一步加快了细胞凋亡的发生[8]。

在全细胞色素C进入胞浆的过程的同时,原癌基因Bcl-2家族也在为转换线粒体的通透性产生重要影响[9]。Bcl-2家族包含促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，其中，促凋亡蛋白包括Bax、Bak、Bid等，抑凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等。其中促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2在Bcl-2基因家族中对调节细胞凋亡起最主要作用[10]。Bax对线粒体的通透性转换起促进作用，Bcl-2对线粒体的通透性转换起抑制作用。线粒体可通过Bax/BAK1依赖性孔或线粒体通透性转换孔(MPT-孔)的开放进行透化[11]。而Bax/BAK1依赖性孔的开放受抗凋亡Bcl-2家族中的Bcl-2蛋白、Bcl-xl蛋白、MCL1蛋白及促凋亡蛋白PUMA所控制，BAX/BAK1孔道开放与否决定了细胞是否凋亡[12]。并有研究发现，当脑组织发生缺血缺氧损伤时，Bcl-2的身份及作用都发生转变，从caspase-3的抑制剂变为caspase-3的底物，其功能也从抑凋亡转变成促凋亡，由此构成了细胞凋亡的反馈回路[13]。

Smac/DIABLO是位于线粒体内的蛋白质，具有调节细胞凋亡的作用。IAP为调节细胞凋亡的重要因子，位于细胞内。Smac/DIABLO可以与IAP结合，通过改变IAP，尤其是逆转X连锁凋亡抑制蛋白(xIAP)来发挥促凋亡作用。当凋亡刺激出现时，线粒体通透性改变，将位于线粒体内的Smac/DIABLO蛋白释放至胞质中并与xIAP结合，改变了IAP的特性，阻止了IAP与caspase-3和caspase-9的结合，使IAP丧失了对caspase活性的抑制作用，恢复了caspase-3和caspase-9的活性，从而造成了细胞凋亡[14-15]。最初，认为细胞凋亡内源性途径只是由Caspase依赖性凋亡通路所介导，即全细胞色素C、原癌基因Bcl-2和第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂在参与细胞凋亡的过程中，全都有半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族参与。近年来发现凋亡诱导因子和核酸内切酶G都是通过非Caspase依赖性凋亡通路对细胞凋亡进行调控[16]。

1.2 非Caspase依赖性凋亡通路

AIF作为细胞凋亡诱导因子，位于线粒体内膜。在凋亡刺激出现时，细胞核内的DNA受损，DNA修复酶(PARP)被激活，AIF转位至线粒体膜间隙或离开线粒体至细胞质中以响应氧化应激，并随PARP一起进入细胞核内[17]。PARP作为caspase的切割底物在进入细胞核后，PARP被活化的caspase 3剪切，使得PARP失去活性，丧失了其修复损伤DNA的功能，与此同时，随PARP一起进入细胞核内的AIF则将核内的DNA聚集并断裂为片段，导致凋亡发生，这也是AIF与其他凋亡相关蛋白的区别之处[18]。另外，当AIF到达细胞质时它还可以改变其他线粒体的通透性，诱导更多的AIF脱离线粒体，造成细胞凋亡的恶性循环[19-20]。

Endo G为细胞凋亡相关蛋白，存在于线粒体内，正常情况下其在线粒体内参与DNA的修复，并与热休克蛋白70(Hsp70)和相关蛋白(CHIP)结合发挥抗氧化应激保护的作用，在经历氧化应激后，处于氧化应激状态的Endo G与Hsc-70和CHIP解离从线粒体释放并转移到细胞核，在核内它降解DNA以实现凋亡[21-22]。AIF与Endo G在众多凋亡相关蛋白中较特殊，因为它们参与细胞凋亡的过程是通过非Caspase依赖性凋亡通路[23]。

2 细胞凋亡外源性通路

死亡受体(DR)属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的一个亚家族，是一类跨膜蛋白。死亡受体的细胞外含有一段富含半胱氨酸的结构域(CRD)，细胞质含有由一同型半胱氨酸组成的同源结构域，有水解蛋白的功能，即与细胞相关的死亡结构域(DD)[24]。当脑组织发生缺血缺氧性损伤时，死亡结构域结合并激活胞浆内介导凋亡信号衔接蛋白造成Caspase活化，引发细胞凋亡。目前，最典型并且研究最多的死亡受体为死亡基因受体(Fas)和肿瘤坏死因子受体(TNFR)，其对应的死亡配体分别为FasL和TNF。

Fas为细胞表面的转膜蛋白，广泛分布在皮质区和海马区的神经细胞和神经胶质细胞内，与凋亡信号的传导密切相关[25]。FasL为Fas的配体,两者结合后发生多聚化改变，致使Fas被激活，激活后的Fas又与Fas相关死亡域蛋白(FADD)结合。此时的FADD与caspase-8两者可通过其自身的死亡结构域(DED)以DED-DED方式结合形成死亡诱导信号复合体(DISC)，并借此激活caspase-8，形成由Fas L、Fas、FADD和caspase-8共同组成的蛋白复合物，该蛋白复合物的作用类似于内源性途径的凋亡小体，可引发下游的caspases活化(如caspase-3)并激活细胞凋亡过程的级联反应，最终引发细胞凋亡[26]。

TNFR受体位于大脑神经元及神经胶质细胞内，其配体为TNF，TNF活性是通过激活低亲和力的肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和高亲和力的肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)这两种受体介导的。当凋亡刺激出现后，TNFR与其配体TNF结合使TNFR1被激活。TNFR1通过自身的死亡结构域与衔接蛋白肿瘤坏死因子受体-1结合蛋白(TRADD)的死亡结构域结合，形成由TNF、TNFR1、TRADD组成的蛋白复合物[27]。一方面，该蛋白复合物可通过与FADD结合，激活FADD与caspase-8发生同源性活化，进一步引发下游的caspases活化(如caspase-2)，造成细胞凋亡过程的级联反应[28];另一方面，TNFR2与相互作用受体蛋白(RIP)可以激活核因子κB(NF-κB)诱导激酶(NIK)并使其活化，从而活化了NF-κB信号途径，诱导一系列基因表达，造成细胞凋亡，导致细胞凋亡的发生[29]。

3 针康法对细胞凋亡通路的干预作用

随着医学技术的不断发展，涌现出许多治疗缺血缺氧性脑损伤的方法，其中以针康法的疗效最为确切。针康法是将传统针灸中的头穴丛刺技术与现代康复理疗技术结合运用的临床新方法[30]。在临床中，针康法可以对脑组织缺血缺氧损伤后所造成的运动功能障碍、感觉功能障碍、言语功能障碍、认知功能障碍及一些常见并发症发挥治疗作用，并提高患者的生存质量和日常生活活动能力，以助其重返社会。在微观角度，众多临床试验和动物实验研究结果表明，针康法可以对缺血缺氧的脑组织发挥保护与调节作用，增强突触的可塑性、保护受损神经元、抑制神经元的凋亡、促进新血管的形成、增加缺血缺氧脑组织半暗带的成活率、加快受损脑组织侧支循环的建立、改善脑部血流量、加速对内源性神经干细胞的增殖与分化、促进缺血缺氧区神经细胞的修复并抑制细胞凋亡[31]。由此可以看出，针康法对细胞凋亡内源性通路和外源性通路的调控为缺血缺氧性脑损伤的治疗发挥了关键作用。

3.1 针康法对细胞凋亡内源性通路的干预作用

针刺头穴可以使Bcl-2的表达水平提高并降低Bax的表达水平。当细胞发生凋亡时，BAX/BAK1孔道开放，诱导全细胞色素C在胞浆中释放，抑凋亡蛋白Bcl-2在针康法的刺激下发挥作用，通过阻止BAX/BAK1孔道的开放来间接抑制全细胞色素C的释放，从而抑制凋亡小体的合成及caspase-3的激活，由此途径抑制细胞凋亡。王洪[32]针刺百会、曲鬓、风池等穴并采用免疫组化法对HIBD大鼠大脑皮层中的Bcl-2和Bax阳性细胞密度进行观测，发现针刺组的Bcl-2表达水平上升，Bax表达水平下降，Bcl-2/Bax比值也有所上调，阻止了细胞凋亡的发生。还有动物实验表明，康复训练可以通过对Cyt C的调控，加强HIBD大鼠对缺血缺氧等病理改变的耐受性，从而改善大鼠的运动功能，促进其神经功能的恢复，并减少细胞凋亡[33]。当脑组织受损后，运用针康法还可以促进IAP与caspase家族的相关蛋白结合，抑制相关蛋白(caspase-3和caspase-9)的活性并抑制全细胞色素C，从而阻止细胞凋亡的发生。唐强等[34]运用免疫印迹法(Western blotting)检测头穴丛刺结合康复训练的针康组半暗区内xIAP和caspase-9的表达情况，发现针康法可以有效降低xIAP和caspase-9的表达，抑制神经细胞的凋亡，促进神经功能的恢复。

因此，针康法可以通过促进Bcl-2的表达、抑制Bax、caspase-3mRNA、caspase-9的表达以及减少Cyt C的释放以对细胞凋亡的内源性途径进行调控，保护神经细胞，减少凋亡数量。

3.2 针康法对细胞凋亡外源性通路的干预作用

头穴丛刺结合康复训练可降低caspase-8等细胞凋亡相关因子的表达水平。徐庆鑫等[35]采用苏木精-伊红染色法(HE)法对针刺组的caspase-8mRNA和caspase-3mRNA的表达进行观测，结果显示针刺可以抑制凋亡相关因子caspase-8mRNA和caspase-3mRNA的表达，以减少细胞凋亡的数量。叶涛等[36]运用免疫印迹法检测针康组大鼠半暗区内caspase-8、caspase-3与细胞凋亡抑制蛋白的数量变化，结果表明针康组大鼠半暗区内caspase-8和caspase-3水平均有下调，细胞凋亡抑制蛋白的表达水平上调，发挥了抑制细胞凋亡的作用。王琼等[37]针刺头部穴位并利用免疫印迹法观察NF-κB的蛋白表达水平，可知头针可抑制NF-κB蛋白水平的过度表达，发挥对细胞凋亡的良性调节作用。孙妲男[38]运用酶联免疫吸附法检测缺血皮质区的TNF和NF-κB的表达，结果发现头穴丛刺结合康复训练的针康组TNF水平和NF-κB转录活性都有所减少。由此可得出结论，针康法对减少缺血皮质区的细胞凋亡发挥促进作用。

以上的动物实验结果表明，针康法对细胞凋亡外源性干预作用是通过抑制caspase-8、caspase-8mRNA、caspase-3mRNA的表达水平影响Fas所介导的凋亡通路，及抑制TNF的表达减少NF-κB的活化实现的，最终阻止或减少细胞凋亡的发生[39]。

4 小结

众多的临床试验和动物实验结果表明，在脑组织缺血缺氧发生后运用针康法进行介入治疗可以促进大脑受损区神经组织的修复、加速大脑微循环的建立、调节细胞信号的传导通路、阻止细胞凋亡的发生，保护受损的脑组织[40-41]。针康法通过对细胞内源性和外源性通路的调控，影响caspase、Cyt C、Bcl-2、Smac/DIABLO、AIF及Endo G等内源性凋亡蛋白和Fas、TNFR等外源性凋亡蛋白的表达来促进减少细胞凋亡的发生。目前，针康法对由线粒体Caspase依赖性凋亡通路介导的细胞凋亡和由细胞凋亡外源性途径即死亡受体介导的细胞凋亡研究较多且取得了满意的结果。但也只是局限于对Cyt C、Bcl-2、Bax、IAP和NF-κB等几个蛋白的研究上，且其详细的机制仍然不是十分清楚。另外，针康法对于线粒体非Caspase 依赖性凋亡通路的凋亡蛋白AIF、Endo G及其他具有明确结构和功能的非典型死亡受体对调往发挥的的调控作用仍处于研究空白阶段，所以针康法能否通过对非Caspase依赖性凋亡通路的凋亡蛋白AIF、Endo G及其他细胞凋亡外源性途径发挥干预作用以抑制细胞凋亡的发生，促进缺血缺氧脑组织的恢复值得期待。