RP—HPLC法测定中药镇痛合剂中栀子苷含量

秦学玲 杨璐璐 任李玥

摘要：目的 建立RP-HPLC法测定中药镇痛合剂中栀子苷的含量。方法 色谱柱为INersil C18 色谱柱（4.6 mm×200 mm，5μm），流动相：乙腈—0.1%磷酸—四氢吷喃（10∶ 90∶ 0.8），流速为1.0 mL/min，检测波长为238 nm，柱温为35 ℃。结果 栀子苷的进样量在0.1324-1.324μg（R=0.9999）范围内呈良好的线性关系；平均回收率为99.74%，RSD=为0.53%（n=6）。结论 该方法快速简便，结果准确可靠，可用于中药镇痛合剂中栀子苷的含量测定；为中药镇痛合剂的质量控制提供科学的依据。

关键词：中药镇痛合剂；栀子苷；高效液相色谱法；含量测定

中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）11-0079-02

中药镇痛合剂是由成都军区昆明总医院研制，由栀子、洋金花等药材提取精制成的中药制剂，具有镇痛消肿、活血化瘀、凉血止血的功效，用于跌打损伤、韧带拉伤所致的肿痛及出血等。栀子为方中君药，本身具有清热解毒，凉血利湿，泻火除烦，消肿止痛的功效[3]。现代研究表明，栀子中含有以栀子苷为主的多种有效成分，栀子苷具有明显的镇痛、消肿和一定抗炎的作用，为栀子抗炎镇痛消肿的有效成分[1-2]。并且栀子苷是栀子中含量测定的法定指标成分[3]。中药镇痛合剂是院内研发制剂，目前尚未建立有效的含量测定方法。因此，本文采用RP-HPLC测定中药镇痛合剂中栀子的主要有效成分栀子苷的含量[3-4]，为全面评价中药镇痛合剂的质量提供了简便快速、准确可靠的方法，为进一步开发使用中药镇痛合剂提供质量基础。

1 仪器与试药

仪器：岛津LC一6AD高效液相色谱仪；岛津SPD一20A紫外检测器（日本Shimadzu）；分析天平（Sarturius CPA 225D，十万分之一）；分析天平（梅特勒AE240，万分之一）；UF 15SFD型超声波（功率300W，频率60kHz）。

试药：中药镇痛合剂（批号：20170612、20170613、20170614）样品由成都军区昆明总医院提供；栀子苷对照品（批号：110749-2012714）由中国食品药品检定研究院提供；阴性样品为自制；甲醇为色谱纯；实验用水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。

2 溶液制备

2.1 对照品溶液 精密称取栀子苷对照品0.01324 g，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL含栀子苷0.2648 mg的对照品溶液。

2.2 供试品溶液 精密量取中药镇痛合剂1 mL，置于具塞锥形瓶中，置水浴上蒸干，精密加入90%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流提取20 min，放冷，再称定重量，用90%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液20 mL，置于50 mL量瓶中，加90%甲醇至刻度，摇匀，再精密量取10 mL，置25 mL量瓶中，加90%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性对照溶液 依照中药镇痛合剂的处方制备缺栀子的阴性样品，按2.2”项下方法制备溶液，既得。

3 色谱条件

色谱柱为INersil C18 色谱柱（4.6 mm×200 mm，5μm），流动相：乙腈—0.1%磷酸—四氢吷喃（10∶ 90∶ 0.8），流速为1.0 mL/min，检测波长为238 nm，柱温为35 ℃。进样量：10μL。

在此色谱条件下，栀子苷对照品，样品和缺栀子的阴性样品的分离色谱图见图1。

4 线性关系考察

精密吸取 2.1项下的栀子苷对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分别置于20 mL量瓶中，加甲醇定容制成浓度分别为13.24、26.48、52.96、79.44、105.92、132.4 g/mL的系列对照品溶液，分别吸取上述各浓度对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标（X），以测得峰面积为纵坐标（Y），线性回归，即得栀子苷回归方程y=3001.7x+29.612（R=0.9999，n=6）线性范围：0.1324～1.324μg。结果表明栀子苷线性关系良好。

5 精密度、重复性、稳定性试验

精密吸取“2.1”项下的栀子苷对照品溶液10 μL，平行进样六次，注入液相色谱仪，以峰面积计算，结果栀子苷RSD 为0.75%。

精密吸取“2.2”项下的供试品溶液，连续进样6次，以色谱峰面积计算，结果6 次测得栀子苷的平均含量为18.01 mg/mL，RSD%=0.08，说明重复性良好。

取同一批号样品（批号：20170612）按上述“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0、3、6、9、12、15、18、24h时，再按“3”项下色谱条件进样测定，以峰面积计算，栀子苷的RSD（n=8）为0.98%。结果表明室温条件下，供试品溶液中的栀子苷化合物在24h内稳定。

6 加样回收率试验

精密称取栀子苷对照品0.18105 g于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.8105 mg/mL的对照品溶液。精密量取此对照品溶液10 mL、分别置于锥形瓶中。取6份，蒸干，备用。精密量取已知含量的同一批（批号：20170612）供试品0.5 mL，6份，分别置于上述錐形瓶中。按“2.2”项下方法制备所需溶液，按含量测定方法操作，测定供试品溶液中各成分的含量，记录峰面积，计算栀子苷的平均回收率为99.74%，RSD 为0.53%（n=6），结果详见表1。

7 含量测定

按上述色谱条件，依法测定3批样品中栀子苷的含量，结果见表2

8 讨论

8.1 流动相的选择[3-6] 流动相的选择方面我们曾使用了甲醇-水、甲醇-0.2%醋酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%醋酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液等系统进行洗脱，结果存在分离不好。而采用乙腈—0.1%磷酸—四氢吷喃（10∶ 90∶ 0.8），作为流动相，分离效果好，峰形对称，重现性好，基线较稳定。

8.2 样品的处理方面 （1）提取溶剂我们考察了以甲醇、90%甲醇水溶液，70%甲醇水溶液，40%的甲醇水溶液为提取溶剂，结果90%甲醇提取效果较好，所以采用90%甲醇为提取溶剂；（2）提取方法我们采用了3种提取方式，分别是超声提取、回流提取、浸渍提取，主要成分的提取结果显示回流提取效果最佳。故确定采用回流提取。

采用HPLC法测定中药镇痛合剂中栀子苷的含量，方法学验证表明其精密度、稳定性、重复性和加样回收率均能满足定量测定要求，方法操作简便，结果可靠。因此，本方法可用于控制中药镇痛合剂的质量，对类似处方制剂的质控也有借鉴作用。

参考文献：

[1]游伟良，平其能，孙敏捷，等.栀子苷的药理学研究新进展[J].药学进展，2012，36（4）：158-161.

[2]吴 虹，魏 伟，宋礼华，等.栀子总苷的抗炎镇痛作用研究[J].中国中医药信息杂志，2006，13（7）：31.

[3]张留记，刘钦松，屠万倩，等.RP-HPLC法同时测定不同产地栀子中栀子苷、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量[J].中国药房，2011，22（7）：630.

[4]笔雪艳，刘晓凤，张清波，等.HPLC法测定清开灵泡腾片中栀子苷的含量[J].中国药房，2011，22（3）：240.

[5]游剑，邓青云，高丽，等.不同工艺对栀子苷提取效果的比较研究[J].江苏农业科学，2012，40（1）：220.

（收稿日期：2018-06-15）