冠心益寿丸的质量标准研究

2018-01-19陈铭勇顾伟李顺清

云南中医中药杂志 2018年11期

陈铭勇顾伟李顺清

摘要：目的建立冠心益寿丸的质量标准。方法采用TLC法对方中丹参、白芍、葛根进行定性鉴别，采用HPLC法对丹参酮ⅡA、葛根素的含量进行测定。结果该制剂中的丹参、白芍、葛根均可用TLC法检出，且空白无干扰；含量测定的阴性对照无干扰，且稳定性、精密度、重现性等指标均符合含量测定的要求。结论本实验方法操作简便，结果准确，重现性好，可作为冠心益寿丸的质量检验标准。

关键词：冠心益寿丸；薄层鉴别；含量测定

中图分类号：R927 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）11-0074-05

冠心益寿丸为本院临床应用20余年的院内制剂，主要由丹参、白芍、葛根等十余味药材组成，以益气化瘀为主，对治疗冠脉介入术后再狭窄具有显著疗效[1]。为将其更好地开发应用，前期研究已将冠心益寿丸由大蜜丸改进为体积更小、携带服用更加方便的浓缩丸并对其提取工艺进行了研究[2]。但前期研究并未建立冠心益寿丸的质量标准，为了有效控制其内在质量，本文建立了丹参、白芍、葛根的薄层色谱鉴别方法，并采用高效液相色谱法对丹参酮ⅡA、葛根素的含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪（包括四元梯度泵，自动进样器，二极管阵列检测器，柱温箱，型号：UltiMate3000，DIONEX，U.S）；色谱柱C18（4.6 mm×250 mm，5μm，S/N：0J7U73，Kromat Universil）；超声仪（型号：SK3300LH，上海科导超声仪器有限公司）；分析天平（型号：AB265-SMETTLER TOLEDO，Switzerland，0.00001 g）

1.2 试药冠心益寿丸（小试样品，批号：170501，170502，170601），芍药苷对照品（美仑生物技术有限公司，供含量测定用，批号：J0516AS），丹参酮ⅡA对照品（成都普瑞法科技开发有限公司，供含量测定用，批号：PRF7052541）；葛根素（成都普瑞法科技开发有限公司，供含量测定用，批号：16032508）。甲醇、乙腈为色谱纯，其余所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 白芍薄层鉴别白芍为本品重要组成成分，芍药苷为其特征成分，参照《中国药典》[3]2015版一部，以芍药苷做对照品，采用TLC鉴别白芍，方法和结果如下：取冠心益寿丸2 g，研碎，加乙醇，超声处理5 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为冠心益寿丸的供试品溶液。取缺白芍的阴性冠心益寿丸，同法制得缺白芍的阴性样品溶液。取白芍粉末0.5 g，加乙醇10 mL，振摇5 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为对照药材的溶液。取芍药苷对照品，加乙醇制成每lmL含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同的颜色斑点。而缺白芍的阴性样品色谱处无此斑点。结果见图1。

2.1.2 丹参薄层鉴别丹参本品主药之一，主要含有丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA，隐丹参酮等成分，其中丹参酮ⅡA为其特征成分，参照《中国药典》[3]2015版一部，以丹参酮ⅡA做对照品，采用TLC鉴别丹参，方法和结果如下：取冠心益寿丸粉末2 g，加乙醇10 mL，超声处理15 min，离心，取上清液作为供试品溶液。取缺丹参的阴性冠心益寿丸，同法制得缺丹参的阴性样品溶液。取丹参对照药材1 g，加乙醇5 mL，超声处理15 min，离心，取上清液作为对照药材溶液。取丹参酮ⅡA对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（7：3）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同的颜色斑点。而缺丹参的阴性样品色谱处无此斑点。结果见图2。

2.1.3 葛根薄层鉴别葛根素为葛根特征性成分，参照《中国药典》[3]2015版一部，以葛根素做对照品，采用TLC鉴别葛根，方法和结果如下：取冠心益寿丸粉末2 g，研碎，加甲醇20 mL，放置2h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺葛根的阴性冠心益寿丸，同法制得缺葛根的阴性样品溶液。取葛根粉末2 g，研碎，加甲醇20 mL，放置2h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为对照药材的溶液。取葛根素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。而缺葛根的阴性样品色谱处无此斑点。结果见图3。

2.2 含量测定丹参、葛根均为冠心益寿丸主药，在提取中分别采用醇提及水提的提取方法。其中丹参中丹参酮ⅡA、葛根中的葛根素含量可作为检驗浓缩提取工艺的重要指标。

2.2.1 丹参酮ⅡA含量的测定

2.2.1.1 溶液配制

对照品溶液的制备：取丹参酮ⅡA对照品，精密称定为0.0032 g，加甲醇定容到10 mL棕色容量瓶中，采用倍半稀释法将对照品浓度稀释一倍，最终制得每1 mL含丹参酮ⅡA对照品0.16 mg的溶液，作为对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取冠心益寿丸粉末2 g，精密称定，加甲醇10 mL，用封口膜封口后放置2h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

阴性供试品的制备：取缺少丹参的冠心益寿丸粉末2 g，精密称定，加甲醇10 mL，用封口膜封口后放置2h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为阴性供试品溶液。

2.2.1.2 色谱条件色谱柱：C18（4.6 mm×250 mm，5μm，S/N：0J7U73，Kromat Universil）；柱溫：30℃，流动相：甲醇：0.1%磷酸水=85：15；检测波长：270nm；流速：0.9 mL/min。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。色谱图见图4（a）、图4（b）和图4（c）。

结果表明：供试品中丹参酮ⅡA与其前后峰的分离度、拖尾因子均能满足《中国药典》2015版高效液相色谱法项下规定，阴性对照品的色谱图在与对照品相同保留时间位置上没有吸收峰，说明该制剂中其他药物对丹参酮ⅡA的含量测定干扰很小，用本法测定其含量专属性较强、灵敏度高。

2.2.1.3 线性与范围将上述制得丹参酮ⅡA对照品稀释100倍后，分别精密吸取对照品溶液2、4、8、10、12、14、16μL注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，以丹参酮ⅡA进样量（μL）为横坐标，作线性回归，得回归方程：y=1.1472x-0.02836，结果表明丹参酮ⅡA在0.32～2.56 mg之间呈良好线性关系。

2.2.1.4 稳定性试验取任意一批冠心益寿丸供试品溶液分别于0h、1h、2h、6h、12h、24h进行测定。每次进样10μL，记录峰面积，计算RSD值。结果显示RSD值为0.79%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.2.1.5 重复性试验取任意一批冠心益寿丸供试品，重复进样6次，每次进样10μL，记录丹参酮ⅡA峰面积，计算结果显示RSD值为0.21%，表明重复性良好。

2.2.1.6 准确度试验称取份同一批号已知丹参酮ⅡA含量的研细的冠心益寿丸6份。每份约2 g，精密称定，精密称取丹参酮ⅡA对照品0.0032 g，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，倍半稀释法稀释一倍，浓度为0.1600 mg/mL，分别精密吸取1.5 mL加入6个样品中。精密吸取10μL，按“2.2.1.2”项下的方法测定峰面积，计算丹参酮ⅡA回收率。丹参酮ⅡA的平均回收率为101.15%，RSD为3.58%，结果见表1。加样回收率=（测得量-样品含量）/标准品加入量×100%。

2.2.1.7 冠心益寿丸中丹参酮ⅡA含量测定称取不同批次冠心益寿丸粉末，每份约2 g，精密称定，按“2.2.1.1”项下同法制备成供试品溶液，分别精密吸取10μL注入色谱仪，记录丹参酮ⅡA峰面积，并计算丹参酮ⅡA含量。结果见表2。

根据七批样品的测定结果，七批样品丹参酮ⅡA平均含量为0.2538 mg/g。初步拟定丹参酮ⅡA应不低于平均含量的 85%，即规定本品丹参以丹参酮ⅡA计不得少于0.22 mg/g。

2.2.2 葛根素含量测定[4]

2.2.2.1 溶液配制

对照品溶液的制备：精密称取葛根素对照品0.0040 g于25 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，最终制得每1 mL含葛根素对照品0.16 mg的溶液作为对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取冠心益寿丸粉末2 g，精密称定，加甲醇10 mL，放置2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

阴性供试品的制备：取缺少葛根的冠心益寿丸粉末2 g，精密称定，加甲醇10 mL，用封口膜封口后放置2h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为阴性供试品溶液。

2.2.2.2 色谱条件色谱柱：C18（4.6 mm×250 mm 5μm，S/N：0J7U73，Kromat Universil）；柱温：30℃，流动相：甲醇：水=25：75；检测波长：270nm；流速：0.9 mL/min。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。色谱图见图5（a）、图5（b）和图5（c）。

结果表明：供试品中葛根素与其前后峰的分离度、拖尾因子均能满足《中国药典》2015版高效液相色谱法项下规定。阴性对照品有轻微干扰，但由于峰形和峰面积与对照品完全不同，故可以认为其他药物对葛根素的含量测定没有干扰，用本法测定葛根素的含量专属性较强、灵敏度较高。

2.2.2.3 线性与范围分别精密吸取葛根素对照品溶液4、8、10、12、14、16、22、24 μL注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积值为纵坐标，以葛根素进样量（μL）为横坐标，作线性回归，得回归方程：y=4.2318x-2.692，结果表明葛根素在0.64～3.84 mg之间呈良好线性关系。

2.2.2.4 稳定性试验取一批冠心益寿丸供试品溶液分别于0、1、2、6、12、24 h进行测定，每次进样10 μL，记录葛根素峰面积，计算RSD值。RSD值为0.71%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.2.5 重复性试验取同一批冠心益寿丸粉末，重复进样6次，每次进样10 μL，记录葛根素峰面积，计算RSD值。结果显示RSD为0.92%，表明重复性良好。

2.2.2.6 准确度试验称取同一批号已知葛根素含量的研细的冠心益寿丸6份，每份约2 g，精密称定，精密称取葛根素对照品0.0020 g，置于25 mL容量瓶中，浓度为0.0800 mg/mL，分别精密吸取3 mL加入6个样品中。精密吸取10 μL，按“2.4.3.1”项下的方法测定峰面积，计算葛根素回收率。葛根素的平均回收率为99.45%，RSD为1.51%，结果见表3。加样回收率=（测得量-样品含量）/标准品加入量×100%。

2.2.2.7 冠心益寿丸中葛根素的含量测定称取不同批次冠心益寿丸粉末，每份约2 g，精密称定，按“2.2.2.2”项下同法制備成供试品溶液，分别精密吸取10 μL注入色谱仪，记录葛根素峰面积，并计算葛根素含量。结果见表4。

根据七批样品的测定结果，七批样品葛根素平均含量为2.4304 mg/g。初步拟定葛根素应不低于平均含量的85%，即规定本品丹参以葛根素计不得少于2.07 mg/g。

3 小结与讨论

在白芍的定性鉴别过程中，通过查阅文献发现宋喜臣[5]采用“取样品2.0 g，加乙醇25 mL，加热回流3h，加乙醇溶解”的方法制得供试品溶液。通过反复实验后发现乙醇超声亦能取得类似的提取率，且超声提取在具有实验周期短、操作简便的方法，故而最终确定采用乙醇超声的方法对供试品进行提取。

在丹参的定性鉴别过程中，查阅文献得知张淑瑜[6]采用乙醚超声提取，罗红丽[7]采用乙醚振摇放置提取。但经预实验发现乙醇超声提取同样具有良好的效果，故供试品采用超声提取法制备。在展开系统的选择中，通过对比《中国药典》和王润梅等[8]的展开系统发现王润梅的展开系统更适用于冠心益寿丸。

在定量测定中，分别选取水提和醇提部分的代表性药物丹参及葛根进行含量测定。经过实验证明，二者的含量测定方法稳定可靠、重复性好、专属性强，适用于冠心益寿丸的质量控制。

参考文献：

[1]曹东，来圣吉，来圣丽，等.冠心益寿丸治疗冠心病318 例疗效总结[J].云南中医中药杂志，1995，16（6）：32-33.

[2]陈铭勇，顾伟，车京梅，等.冠心益寿丸（浓缩丸）的提取工艺研究[J].云南中医中药杂志，2016，37（10）：75-77.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[4]李铁强，肖楠.高效液相色谱法测定消渴平胶囊中葛根素含量[J].医药导报，2010，29（11）：1495-1496.

[5]宋喜臣.保肝丸制备工艺及质量标准研究[D].吉林大学，2014.