黄芪亵术汤治疗肝纤维化的研究

付作辉，李先伦，赵芹峰

（山东省嘉祥县中医院，山东 济宁 272400）

本研究通过观察黄芪亵术汤在大鼠肝纤维化模型干预治疗后肝功能、肝组织中纤维化血清标志物透明质酸的含量变化，评价其在抗肝纤维化中的作用。

1 材料与方法

1.1 药物和主要试剂

黄芪亵术汤由生黄芪30 g，红花10 g，亵术15 g，炒白术10 g，醋柴胡10 g，地鳖虫5 g，生甘草10 g，白矾5 g，组成。黄芪提取物的制备：粉碎用蒸馏水1000 mL，冷水浸泡24h后，加热煮沸30 min，倾出上清液，以此方法煮沸共3次，合并3次上清液，小火浓缩至150 mL，制备药液，待凉后用滤纸过滤，放人冰箱备用，临用前配成所需浓度。

1.2 实验分组与处理

1.2.1 建立大鼠肝纤维化模型

轮替给雄性SD大鼠四肢内侧皮下注射四氯化碳植物油混合液，按0.3 mL/100g体重的剂量，每周注射两次，连续注射后8周。

1.2.2 实验分组

取雄性SD肝纤维化模型大鼠40只，随机分为2组，一组（实验组）给予黄芪亵术汤（协同方）灌胃，每天2次，每次10毫升，对照组给予NS同样剂量灌胃，每天2次；灌胃8周后留取血清标本，随后处死大鼠，留取肝组织待检。

1.2.3 肝功能检测方法

取大鼠血清测定ALT、AST；肝纤维化：取大鼠血清用放免法测定HA的含量。常规方法下对免疫组化检测组织实施脱蜡以及脱水处理，选择马血清对非特异性抗原进行封闭处理，通过枸橡酸盐缓冲液0.1 mol/L实施微波处理，选取H2O230%将内源性过氧化物酶除去，相应将兔抗大鼠多克隆抗体TgF-β1（1:100）、MMP-13（1:100）及TIMP-1（1:100）滴入其中，置于4℃环境下过夜，阴性对照选择PBS进行一抗代替，通过即用型SP免疫组化试剂盒的方法，实施DAB显色、脱水、透明，利用中性树胶进行封片，相应对组织中TIMP-1、MMP-13、TgF-β1的水平实施测定。阴性片没有着色表现，阳性片细胞胞质中有棕黄色表现，通过半定量方法对免疫组化结果实施判断，每张切片各个位置对高倍镜视野5个进行随机观察，对其显色程度及相应范围进行详细记录。显色程度表示：弱＋、中＋＋、中强+++、强＋＋＋＋。

1.2.4 显色范围

如果在高倍视野中占比＜1/4为＋，占1/4～2/4为＋＋，占2/4～3/4为＋＋＋，＞3，4为＋＋＋＋。然后进行显色指数计算，计算方法=显色程度×显色范围，其中＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋相应记为1，2，3，4分。类蛋白表达的显色指数最终结果为均数。

1.3 统计学方法

通过软件SSPS 18.0，用方差分析比较两组有关计量资料含量的差别。

2 结 果

黄芪亵术汤干预治疗后肝纤维化大鼠血清ALT、AST活性明显降低（P＜0.01），结果见表1。HA的含量明显降低（P＜0.05）。

表1 肝纤维化大鼠黄芪提取物治疗后血清ALT、AST活性及HA含量的变化（±s）

表1 肝纤维化大鼠黄芪提取物治疗后血清ALT、AST活性及HA含量的变化（±s）

组别 动物数 AST（卡门氏单位） ALT（卡门氏单位） HA（μg/L）NS对照组 20 727.00±64.08 617.25±104.59 328.21±70.68黄芪亵术汤 20 79.40±19.05 167.40±32.21 241.88±77.77 t 30.21 19.35 23.87 P＜0.01 ＜0.05 ＜0.05

3 讨 论

模型组与阳性对照组比值仅为正常的1/2倍，通过黄芪亵术汤有效剂量实施干预之后，实施免疫组化实验，结果显示：模型组TIMP-1在间质细胞胞质（中央静脉周围、纤维间隔、肝窦部位）中能够发现大量棕黄色着色，以上位置MMP-13也出现少量表达，选择黄芪亵术汤有效剂量后，TIMP-1的表达得到显著缓解，但是MMP-13的表达出现明显上升，所以经降低基因和蛋白水平，能够使TIMP-L的表达降低、MMP-13表达提高，加快ECM过多的降解，缓解肝纤维化的严重性[1-3]。本实验中，黄芪亵术汤可明显降低大鼠肝纤维化血清ALT和AST活性，降低HA含量。有效剂量组相较较模型组和阳性对照组大鼠肝组织TgF-β1基因和蛋白表达都更低。因为黄芪亵术汤有效成分对HSC的激活形成了抑制，减少了TgF-β1释放，从而减少了致纤维化因子释放，所以减轻了肝纤维化的程度.不过黄芪亵术汤中有效成分有多种，具体哪一种成分能够对HSC的激活形成抑制，还需往后更为深入的研究。

[1]陆石俊,刘辉华,谢 武,等.中药联合臭氧自血疗法治疗乙肝肝纤维化临床观察[J].中国急救医学,2015,35(z2):282-283.

[2]李春辉,潘理会.中药强肝溶纤汤-2对肝纤维化治疗作用的实验研究[J].实用医学杂志,2013,29(18):2979-2982.