克里米亚-刚果出血热病毒新型治疗性抗体研制展望

刘 欢(LIU Huan)，张怀东(ZHANG Huai-dong)，陈晓晖(CHEN Xiao-hui)，龚 睿(GONG Rui)

(中国科学院武汉病毒研究所，湖北 武汉 430071)

随着人们认识的增加，烈性传染性病毒不断被发现和鉴定，高致病性、高传播性的病毒往往由于变异，导致反复流行。如在非洲和阿拉伯半岛多次暴发1931年首次分离到的裂谷热病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)[1]；1937年发现于非洲，并于1999年传入美国且在多个州暴发的西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)[2-3]；1944、1956、1965年分别发现于俄国克里米亚、非洲刚果和我国新疆巴楚地区的克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus，CCHFV)，1967年分离出该病毒，被我国称为新疆出血热病毒(Xinjiang haemorrhagic fever virus，XHFV)[4]。1967年在德国首次发现马尔堡病毒(Marburgvirus，MARV)[5]；1976年发现，随后在非洲反复暴发流行的埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)[6]；1998—1999年在马来西亚暴发，2001—2009年连续在印度和孟加拉国流行的尼帕病毒(Nipahvirus，NiV)[7-8]；2002年底出现，2003年在我国暴发流行的SARS冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)[9]；2012年出现于沙特阿拉伯，具有高致死率的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)[10]；2013年在我国多地出现的H7N9型流感病毒[11]。自2009年以来，中国加强了急性发热性疾病的监测与管理，发现了一种不明原因的严重发热伴血小板减少综合征(SFTS)，该病由一种新型病毒引起，命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒，简称新布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome visus，SFTSV)[12]。目前，上述病毒感染几乎没有特效药物和疫苗，因此，针对其研制特效药物，对于提高其防治水平、保障我国国民健康，具有非常重要的意义。

1 克里米亚-刚果出血热病毒

克里米亚-刚果出血热最初源于20世纪40年代中亚克里米亚半岛，病原体为CCHFV。克里米亚-刚果出血热是一种流行于俄国北部、中东、南部欧亚大陆和非洲撒哈拉地区的烈性传染性疾病，主要见于无树的大平原、半沙漠地带及丘陵地区，病死率为20%～70%[13]，该病分布具有明显的地域性[14-18]。1965年在我国新疆南部巴楚地区首次发现此种疾病，CCHFV在我国又被称为XHFV。新疆出血热是目前我国发现的四种虫媒病毒性传染病之一[18]。在青海、云南、四川、内蒙、安徽、海南、伊犁、东北等地均有抗体阳性案例的报道，并证实在新疆塔里木盆地、准噶尔盆地、塔里木河，云南腾冲、寻甸、西双版纳和孟连、伊犁河谷边境地区、青海等存在XHFV自然疫源地[19]。近年来，新疆出血热在我国再度暴发，疫区不断扩大，危害日益严重。CCHFV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的内罗病毒属(Nairovirus)[20]。根据第七届国际病毒学分类委员会报告，内罗病毒属包括34种由硬蜱科(Ixodidae)或者隐喙蜱科(Argasidae)传播的病毒，分为七个血清型[21]，其中最重要的是克里米亚-刚果出血热血清型和内罗毕羊病(Nairobi sheep disease)血清型。内罗毕羊病毒主要感染绵羊和山羊，也可以引起人轻度发热和血小板减少[22]。

1968 年Murphy等[23-24]第一次描述了CCHFV在乳鼠脑中具有与其他布尼亚病毒科病毒相似的形态。在病毒基本结构、形态发生、复制循环以及理化性质等方面，CCHFV可作为布尼亚病毒科的典型代表[20, 25-28]。CCHFV基因组由大(L)、中(M)、小(S)三股负链 RNA 片段组成，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)、糖蛋白(glycoprotein，GP)及核蛋白(nucleoprotein，NP)[29]。三个基因组分别包含一个开放读码框，两侧为非编码区。每个基因组末端11个碱基是保守的，并且除第9位核苷酸外均互补，在随后的20个左右碱基显示片段特异性互补，形成螺丝状或锅柄状结构[30]。

CCHFV mRNA编码的糖蛋白前体，经翻译后加工成为成熟的G1和G2[31-33]。成熟的G1和G2嵌入脂质层，形成刺突状结构[34]。蛋白G1和G2也分别称为Gc和Gn，在介导病毒与受体结合，进入宿主细胞中起关键作用，病毒感染后产生的中和性抗体也主要靶向该区域[35]。成熟的糖蛋白能识别易感宿主细胞上的受体并能诱导中和抗体的产生[36]。Gn只在病毒成熟的末期产生，目前研究[37]认为，Gn主要起分子伴侣作用，帮助Gc正确折叠，而Gc介导了与受体的结合，其潜在受体可能是核仁素(nucleolin)。

CCHFV由蜱虫叮咬传播，重症患者的血液与排泄物也具有传染性。该病毒具有传播迅速、致死率高、暂无有效治疗药物[35, 38-39]等特点，开发针对CCHFV的特效药物，对于提高我国对该病毒的防治水平，保障国民健康具有十分重要的意义。

2 治疗性抗体

生物治疗中的蛋白质类大分子药物通常包括生长因子、受体、酶、血液因子、抗凝血剂、重组疫苗、融合蛋白和单克隆抗体等，而单克隆抗体则越来越受到人们的关注[40]。美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准三十多种单克隆抗体用于治疗各种疾病，如癌症、免疫系统疾病等[41]。2001年以来，治疗性抗体的市场以每年35%的速度增长，是生物类药物中增长最快的[19]。近年来，一些大的制药公司也在收购其他抗体公司方面展开激烈竞争，如AstraZeneca公司于2007年花156亿美元巨资买下MedImmune公司，而后者的主打产品之一是一种预防呼吸道合胞病毒感染的单克隆抗体Palivizumab(商品名Synagis)[42]，由此可见治疗性抗体的重要性。

治疗性抗体的显著优势是其天然存在于人体内，相对安全，同时具有功能强大和靶向性高的特点，为治疗目前难以攻克的疾病带来新的希望。如最近鉴定一系列针对人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)的具有广谱中和活性的抗体(如VRC01[43-44])，有的已进入一、二期临床试验(如PRO140[45-46]和TNX-355[47-48])，显示出治疗性抗体在防治HIV-1上具有很好的应用前景[49-50]。

然而，随着研究的不断深入，人们发现全长抗体的分子量较大(～150 kD)，组织(如实体瘤)渗透性较差，也难以结合一些空间上有位阻效应的关键表位(如病毒囊膜蛋白上的中和性位点)，从而影响活性。解决的策略之一是将全长抗体进行小型化[51]，由此开发了一系列具有结合功能的抗体片段，如Fab(50～60 kD)、单链抗体(scFv，20～30 kD)、重链可变区抗体(VH，12～15 kD)(单域抗体)等小型化抗体。上述抗体片段相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力，有些甚至能够口服用药。目前，基于人重链可变区VH的单域抗体已经被用于研发针对病毒的候选抗体类药物[48, 51]。已有开发以抗体Fc片段的CH2结构域为骨架的单域抗体，称之为纳米抗体。该纳米抗体的分子量与VH形式的单域抗体相似，但是具有相对较长的血浆半衰期[52]。

已有研究[53]表明，病毒感染后产生的抗体对CCHFV具有中和作用，并且主要靶向病毒的囊膜蛋白。因此，通过抗体工程技术筛选出针对该病毒囊膜蛋白具有中和活性的单域抗体dAb或者nAb，有望开发成一类新的抗CCHFV的候选抗体药物。

3 中和活性评价系统

疱疹口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)是典型的带有包膜蛋白的动物病毒，由于其庞大的宿主范围，并能在很多哺乳动物细胞和昆虫细胞中稳定地复制，被广泛地应用于研究中。VSV组装使用时是删除了糖蛋白G基因的重组VSV。重组rVSV-ΔG与异源病毒包膜蛋白一起生成VSV假病毒颗粒[54]。已有研究构建了以VSV为基础的假病毒体系VSV-CCHFVG[55]。首先在293FT细胞内分别表达CCHFV糖蛋白前体G和β-半乳糖苷酶(作为对照)，然后用带有萤火虫荧光素酶报告基因的委内瑞拉马脑炎病毒糖蛋白(VSV-VEEVGP，Venezuelan equine encephalitis virus glycoprotein)假病毒侵染细胞。委内瑞拉马脑炎病毒糖蛋白VEEVGP在细胞内很快降解，VSV核心复制、组装的子代病毒将带有CCHFV糖蛋白，形成VSV-CCHFVG假病毒。侵染48 h后收集病毒，加入到SW13单层细胞中，通过测萤火虫荧光素酶酶活性评估病毒的滴度。在缺少高等级生物安全实验室的情况下，CCHFV模型的建立使得体外稳定、高效地获得感染性病毒颗粒并用于中和抗体的检测与评价成为可能。

4 囊膜蛋白分类与抗原设计

目前，依据病毒囊膜蛋白融合前后的结构模式，将病毒囊膜蛋白分为三类：ClassI、ClassII和ClassIII。ClassI型囊膜蛋白分类的依据主要是其均能形成一个含有α-螺旋的卷曲螺旋结构中心的发夹三聚体；ClassII型囊膜蛋白分类的依据主要是其均能形成含有β-折叠结构的发夹三聚体[56-64]。ClassIII型囊膜蛋白也能通过两部分结构的组合，形成发夹三聚体(与ClassI型囊膜蛋白类似)，融合后的三聚体也含有α-螺旋三聚体核心；然而每个融合区域暴露出两个位于延长的β-折叠顶端的融合环，显著的表现出与ClassII型囊膜蛋白结构上的类似之处[65-67]。已有预测研究[64,68]表明，CCHFV的囊膜蛋白Gc属于ClassII型囊膜蛋白。虽然这类蛋白缺少明显的保守氨基酸序列，但是其二级结构和三级结构是保守的，结构非常相似。

使用TMHMMServer(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)预测CCHFV囊膜蛋白Gc在胞外区、跨膜区和胞内区的分布。跨膜区和胞内区因存在空间位阻，不能成为其功能性表位。然后用NetNGlyc对囊膜蛋白糖基化位点进行预测，糖基化对表位形成有一定影响，可能会改变或形成新的表位。利用两个抗原表位预测服务器，(1)ClusPro: protein-protein docking/Antibody Mode(http://cluspro.bu.edu)；(2)MIF Bioinformatics: Predicted Antigenic Peptides(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)，联用亲水性、柔韧性、可及性、转角等多参数进行抗原表位预测。综合考虑跨膜区和抗原表位预测结果及囊膜蛋白的高度变异区，确定分段表达策略，逐步缩小抗原表位区域。表达、纯化这些结构域，可以作为抗体筛选的靶点。

5 展望

中和性抗体是烈性病毒感染防控的特效药物，如已经研制出的针对EBOV的抗体药物ZMapp，取得了很好的效果。目前，已有的针对烈性病毒的中和抗体多为全长单克隆抗体(主要为IgG形式)，分子量大，不容易结合大分子(如病毒囊膜蛋白)上空间存在位阻效应的关键表位；而且结构复杂，需在哺乳动物细胞中表达，制备周期长，一般情况下需要在低温储存，难以适用于复杂环境。

相对于全长克隆抗体、Fab和scFv，单域抗体(包括dAb和nAb)能更有效靶向病毒囊膜蛋白上那些关键而狭小的保守区域，发挥中和活性；富含β折叠，结构简单可原核表达，易于制备，常温下仍保持稳定，适宜在复杂的环境中储存和使用；筛选能够中和CCHFV的单域抗体，有望开发出抗CCHFV的新候选药物，单域抗体具有广阔的应用前景。