侵袭性真菌病血清学检测研究进展

周梦兰 ， 徐英春 ， 赵玉沛

近年来，条件致病性真菌感染，特别是深部真菌病的发病率和病死率呈明显上升趋势[1]。侵袭性真菌感染是深部真菌病中危害最大的一类，常发生于免疫功能低下如接受造血干细胞移植的患者，其病情进展快，病死率可达50%[2]。早期快速诊断有助于及时控制病情，改善预后。由于侵袭性真菌病（IFD）临床表现及体征不典型，且常被基础疾病掩盖，因此其诊断主要依赖于实验室检查。传统的真菌实验室诊断方法主要包括真菌镜检、培养和组织病理鉴定，但这些诊断方法的特异度和灵敏度均较低，检测周期长，存在诊断延迟的可能，而创伤性诊断手段常受到患者病情和身体状况的限制。灵敏、特异、早期、快速的非培养诊断方法已成为IFD研究领域的焦点。随着检测技术的进步，目前与传统检测方法不同的其他技术开始在IFD检测领域发挥越来越重要的作用，包括血清学检测技术以及分子生物学检测技术。IFD血清学诊断主要包括抗体检测及抗原、代谢产物检测两大类，本文就这两方面作一综述。

1 抗原及代谢产物

1.1 （1, 3）-β-D-葡聚糖（BDG）

BDG广泛存在于真菌细胞壁中（除接合菌外），可占其干重的50%以上，而其他微生物、动物及人的细胞则不含这种成分。人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使得血液及其他体液（如尿、脑脊液、腹水、胸水等）中BDG含量增高。在无内毒素存在的情况下，BDG可以活化鲎变形细胞裂解物中的G因子并产生凝集反应。以此反应原理为基础的G试验可以特异性检测BDG。因此，如果在血液或其他无菌体液中检测到BDG，就提示可能存在真菌感染，但也有其局限性。以下情况下G试验可能出现假阳性，如：使用纤维素膜进行血液透析的患者，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；患者静脉输注凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白；使用抗菌药物如头孢西丁、头孢唑林、甲氧苄啶、头孢噻肟、头孢吡肟等；标本溶血、脂血、黄疸；使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的黏膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性；此外，由于G试验的测定原理与内毒素十分相似，所以易受血中革兰阴性菌的干扰，造成假阳性。有研究发现1例大肠埃希菌感染者G试验为阳性，其测定值大于120 pg/mL[3]。在诊断隐球菌或接合菌（根霉/毛霉）感染时，G试验常出现假阴性结果，可能与其生长缓慢，形成厚壁胞膜有关。临床常见的肺曲霉病，由于有厚壁空洞的包绕，真菌胞壁的结构成分难以被释放入血，也会出现假阴性结果。

由于BDG广泛存在于真菌细胞壁中，因此G试验可以检测除隐球菌和接合菌以外的多种病原真菌，包括念珠菌、曲霉、镰刀菌、肺孢菌、地霉和毛孢菌等感染。目前，国内外使用的G试验试剂盒种类繁多，不同的试剂盒存在原料、检测方法及阈值的差异，加之导致G试验假阳性的因素众多且难以避免，G试验结果阳性只表明存在深部真菌感染，但不能提示为何种真菌[4]。连续2次或更多次G试验阳性可提高G试验对IFD诊断的特异度，对于IFD早期诊断有一定价值，且该指标能动态反映感染程度和抗真菌治疗疗效，但需要关注结果的假阳性。念珠菌定植不引起G试验升高。因此在临床工作中建议：与半乳甘露聚糖检测试验（GM试验）联合以提高阳性率；2次或2次以上阳性结果可降低假阳性率；高危患者建议每周检测1～2次；并对高危人群进行动态监测。

1.2 半乳甘露聚糖（GM）

GM是第1个用于侵袭性曲霉病诊断的特异性抗原，菌丝生长时，GM从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原，主要用于急性侵袭性曲霉病的诊断[5]。GM释放量与菌量呈正比，可以反映感染程度，所以可以作为疗效的评价指标。可检测的标本类型包括血清、血浆、支气管肺泡灌洗液（BALF）或脑脊液，主要通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或酶免疫测定（EIA）进行测定，灵敏度可达0.5～1.0 ng/mL[5]。以下情况下GM试验可能出现假阳性，如：静脉用哌拉西林-他唑巴坦；使用免疫球蛋白、血液制品；大剂量使用激素；透析；化疗的严重黏膜炎的患者；儿童和新生儿。另外，抗真菌药物，如三唑类抗真菌药物的使用可降低GM水平，尤其是预防性使用伊曲康唑，轻度的侵袭性曲霉病和低曲霉负荷量可导致GM试验阴性[6]。

研究显示GM试验可推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植受体（灵敏度为70%～82%，特异度为86%～92%），但不推荐用于实体器官移植受体（灵敏度 22%）[7]。荟萃分析显示，GM试验对侵袭性曲霉病的灵敏度和特异度为71%～87%和89%，而BALF中GM试验的灵敏度可能要高于血清GM试验[8]。因此临床检测推荐同时检测BALF和血清的GM水平，以提高其检测灵敏度，但需要注意其交叉反应可发生于以下菌种的感染：马尔尼菲篮状菌、拟青霉、深红酵母、新生隐球菌、头地霉、枝顶孢霉、链格孢霉等。同时，研究表明G试验和GM试验联合检测可更有效诊断侵袭性曲霉病[9]。

1.3 隐球菌荚膜多糖

隐球菌感染后在体内可形成大量荚膜多糖并释放进入血液和脑脊液，通过检测荚膜多糖抗原可早期诊断隐球菌感染。胶乳凝集试验检测隐球菌荚膜抗原是最有诊断价值的快速血清学方法之一，可方便、快速、准确地从脑脊液或血中检测出多糖抗原，其灵敏度高于常规墨汁染色和培养[10]。早期检测试剂主要以多克隆抗体IgG为基础，灵敏度可达99%，但有时受血中或体液中某些成分如类风湿因子（RF）等干扰，造成假阳性结果。以鼠单克隆抗体IgM为基础的乳胶试剂虽不与RF发生交叉反应，但灵敏度不如多克隆抗体试剂盒。假阴性结果主要由前带效应（抗体过量）引起，可对样本进行一定稀释后再检测。现有的隐球菌抗原检测商品化试剂盒采用多克隆抗体捕获抗原，再用单克隆抗体进行检测，可同时提高灵敏度和特异度。此外，通过对荚膜多糖抗原的定量检测可用于对患者的疗效评价，但在免疫功能低下患者（如AIDS患者）中应用时应结合其他实验室结果进行解释[11]。

1.4 甘露聚糖

甘露聚糖是念珠菌细胞壁另一重要组成成分，主要结构为D-甘露糖，对热稳定，主要用于检测侵袭性念珠菌病，一过性或导管相关性念珠菌血症基本检测不到甘露聚糖抗原。但是，由于血清中甘露聚糖清除较快，因此需重复采样进行检测，每周2～3次，可通过不断改进检测方法，如检测前加热血清使免疫复合物解离、采用单克隆抗体检测特定靶位等提高灵敏度[12]。

1.5Cand-Tec抗原

Cand-Tec抗原是念珠菌属的一种热敏糖蛋白抗原，可用一种颗粒凝集试验系统（又称Latex凝集法）检测。Misaki等[13]研究者利用微滴度法对12例急性白血病化疗后发热的患者进行Cand-Tec抗原检测，发现其滴度均有明显增高，灵敏度和特异度分别达100%和80%，抗真菌药物治疗后，75%患者Cand-Tec抗原滴度降低，治疗无效者其抗原滴度未见降低。研究结果提示Cand-Tec抗原检测可用于早期诊断深部念珠菌病，连续监测可评价疗效，但阳性结果受RF的干扰，故仅用Cand-Tec试验尚难确诊深部念珠菌感染。

1.6 烯醇化酶

烯醇化酶是一种胞质抗原，又称2-磷酸D-甘油盐水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，广泛存在于念珠菌细胞中，在深部念珠菌感染时可大量释放入血，而寄生在浅表部位的念珠菌不会释放该酶，故具有很高的临床应用价值，但目前尚无检测烯醇化酶抗原的商品化试剂。

1.7D-阿拉伯糖醇

D-阿拉伯糖醇是白念珠菌感染人体的产物。检测血清中D-阿拉伯醇或D-阿拉伯糖醇与L-阿拉伯醇的比值，可帮助临床诊断某些念珠菌如白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、乳酒念珠菌引起的深部感染，但不能检测克柔念珠菌和光滑念珠菌感染[14]。

1.8 荚膜组织胞浆菌多糖抗原（HPA）

播散性荚膜组织胞浆菌病和有严重肺部感染症状患者的血、尿、BALF、脑脊液中均可检出HPA[15-16]，目前主要通过放射免疫法进行测定，可用于荚膜组织胞浆菌的诊断和治疗效果监测，但是由于检测试剂具有放射性，限制了其在临床的常规应用。

2 抗体检测

与真菌抗原检测相比，真菌血清特异性抗体检测的研究和临床应用相对滞后，其主要原因是过去人们认为抗体检测的特异性较差，不能区分是体内定植还是感染；而机会性真菌感染常发生在机体免疫功能低下的人群，难以产生足够量的抗体，易发生假阴性[17]。但是近年来的研究表明，定植和感染的患者其特异性抗体水平存在显著差异；而存在免疫缺陷的患者也可以产生足够的抗体水平从而用于IFD的诊断。同时，随着人们对慢性真菌病如慢性肺曲霉病（CPA）认识的加深，真菌特异性抗体检测已经成为IFD诊断的重要方法。目前用于IFD诊断的抗体标志物择要介绍于下。

2.1 白念珠菌牙管特异性抗体（CAGTA）

CAGTA可用于侵袭性念珠菌病的早期诊断，包括白念珠菌和非白念珠菌，研究显示在危急和非危急念珠菌病患者中其灵敏度和特异度分别达77%～89%，91%～100%。此外，采用微滴度法连续监测CAGTA浓度可以对治疗效果进行监测。在一项大型回顾性多中心研究中，研究者发现危重患者CAGTA检测阳性率达41.5%，以手术患者居多，占60%，随着抗真菌药物的治疗，CAGTA滴度随之增加，患者的病死率也随之降低[18]。

2.2 甘露聚糖抗体

甘露聚糖抗原是念珠菌细胞壁的重要组成成分，但在血液中清除较快；甘露聚糖抗体的检出则不能确定感染或定植，但研究显示，甘露聚糖抗原/甘露聚糖抗体联合检测可提高侵袭性念珠菌病的阳性率[19]。一项纳入血液肿瘤和危重患者的系统性回顾研究显示，甘露聚糖抗原/甘露聚糖抗体联合检测优于其单独检测，灵敏度和特异度分别达83%和86%[20]。值得注意的是，甘露聚糖抗原/甘露聚糖抗体联合检测效果对不同念珠菌种也有所差异，白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌效果最好，而对近平滑念珠菌、克柔念珠菌效果最差[21]。

2.3 曲霉抗体检测

与GM抗原相比，曲霉抗体的检测，主要在慢性及过敏性曲霉病的诊断中发挥关键作用。慢性曲霉病中升高的抗体主要为IgG，过敏性曲霉病中升高的抗体主要为IgA和IgE，不同患者因个体差异也会出现抗体水平的交叉，但在免疫缺陷患者中，抗体水平升高可能会延迟或消失[5]。现有的检测方法包括凝胶沉淀法、双向免疫扩散法、血细胞凝集法、补体结合法、ELISA和免疫印迹法，但各种方法因其阈值和检测抗体的不同，很难标准化。2016年更新的美国IDSA曲霉病诊断与处置指南中，强烈推荐血清和BALF GM试验用于恶性血液病和造血干细胞移植患者侵袭性曲霉病的检测[22]。

2.4 双相真菌特异性抗体

一些特殊的双相性真菌，主要是用常规方法难以诊断的地方性机会性真菌感染，如芽生菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病、副球孢子菌病和青霉病，可以用其特异性抗体进行早期诊断。检测方法包括：ELISA检测特异性IgM和IgG抗体及其滴度；补体结合试验检测抗体及其滴度；免疫扩散法检测特异性抗体。早期研究报道显示，在荚膜组织胞浆菌感染的抗体检测中，ELISA和免疫扩散法检测IgG抗体的方法敏感度分别达97%、100%，特异度分别达到84%和100%[23]。

3 临床意义

为了进一步规范IFD的诊断，国际和国内许多医学专业委员会及机构先后制定了诊断标准，其中最具有权威性和影响性的是欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组（EORTC/IFICC）和美国真菌病研究组（MSG）所制定的诊断标准[24]。该诊断标准将IFD的诊断分为确诊（proven）、临床诊断（probable）和拟诊（possible） 3个层次，并分别从宿主因素、临床标准、微生物学标准和组织病理等4个方面进行诊断。G试验、GM试验和隐球菌抗原检测均被该标准列入微生物学标准。同时，中华医学会不同专业委员会也根据我国的实际情况和特点，参考欧洲和美国等标准制定了我国自己的IFD诊断标准。无论在国际还是国内的标准中，G试验、GM试验和隐球菌抗原检测均被列入微生物学标准[25]。由此可见，G试验、GM试验和隐球菌抗原检测在IFD的诊断中具有重要的地位。

3.1G试验

由于BDG广泛存在于真菌细胞壁中，因此G试验可以检测除隐球菌和接合菌以外的多种致病真菌，包括念珠菌、曲霉、镰刀菌、肺孢菌、地霉和毛孢菌等。国内外IFD的诊断标准中都将G试验检测结果列入微生物学标准[26-31]。值得注意的是，在肺真菌病诊断和治疗专家共识[27]、实体器官移植患者侵袭性真菌感染的诊断和治疗指南[28]和重症患者侵袭性真菌感染诊断与治疗指南[29]中都强调了连续2次G试验阳性结果在IFD诊断中的重要性。

3.2GM试验

除G试验外，国内外侵袭性真菌病的诊断标准也将真菌GM试验列为IFD诊断的微生物学标准[1，26-30]。和G试验类似，多个国内指南[27-29]均强调了连续2次GM试验结果阳性在诊断中的重要意义。指南中也指出，对于肺曲霉病，BALF GM试验检测可能优于血清GM检测。但同时，指南中也指出GM试验对器官移植患者的检测效果不佳以及预防治疗会影响GM试验检测结果。

3.3 隐球菌抗原检测

在EORTC/MSG 2008年的侵袭性真菌诊断标准和国内的隐球菌感染诊治专家共识（2010）中，脑脊液隐球菌抗原检测阳性可以作为播散性隐球菌病确诊的证据，而隐球菌抗原检测也被列为其他隐球菌感染的重要微生物学证据[32]。

3.4 念珠菌特异性抗原抗体检测

虽然G试验对于IFD的检测有很大的作用，但是其无法区别不同属间的真菌感染。而念珠菌的抗原抗体检测则可以特异性识别侵袭性念珠菌感染。这其中，又以念珠菌甘露聚糖抗原检测和甘露聚糖抗体检测最具有代表性。在2012年ESCMID念珠菌病诊断和治疗指南中[33]，推荐使用念珠菌甘露聚糖抗原检测和甘露聚糖抗体检测作念珠菌血症和慢性播散性念珠菌病的诊断方法（Level II）。而在2012年欧洲白血病感染会议指南[20]中也推荐使用念珠菌甘露聚糖特异性抗原和抗体检测作为侵袭性念珠病的诊断方法，并且特别强调了甘露聚糖抗原和抗体联合检测效果要优于抗原或抗体单独检测。

3.5 曲霉抗体检测

过去人们对曲霉抗体检测的研究并不清楚，随着近年来对侵袭性曲霉病研究的深入尤其是对CPA认识的加深，以及GM试验对CPA的诊断效果不尽如人意，科研人员越来越重视曲霉抗体检测在侵袭性曲霉病尤其是慢性曲霉病诊断中的作用[5]。在2015年出版的欧洲慢性肺曲霉病诊断和治疗的临床指南中[34]，特别强调了曲霉IgG抗体检测、曲霉IgM抗体检测和曲霉IgE抗体检测在CPA诊断中的重要作用。2016年更新的美国IDSA曲霉病诊断与处置指南中，更是强调了曲霉IgG抗体检测是慢性空洞性肺曲霉病诊断中最灵敏的微生物学方法[22]。

综上所述，真菌抗原及其代谢产物检测、真菌抗体血清学检测作为非传统培养的真菌检测手段，已在临床检测领域有较广泛的应用，但其灵敏度和特异度有待进一步提高，尤其是操作程序的标准化方面需要取得一致，以利于实验室之间的比较和临床应用。应将传统的形态学检查、培养法与非培养法结合起来，对真菌感染诊断提供可靠的实验室依据。

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