PLIN2对脂类代谢的调控研究

胡濒月 黄 英 杨明华 潘洪彬 赵素梅

云南农业大学动物营养与饲料重点实验室，云南昆明 650201

PLIN2 作为一种脂肪分化相关蛋白分布在脂滴表面，参与脂质代谢，用于了解机体内脂质蓄积的程度。当机体受病理因素影响时，便打破了PLIN2 与中性胆固醇酯水解酶（NCEH）之间的动态平衡，导致PLIN2 过度表达，NCEH 阻止胆固醇的外流，使得细胞内胆固醇酯大量蓄积形成泡沫细胞，而泡沫细胞的形成作为早期动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）的一个典型特征[1]。本文旨在探讨引起PLIN2 过度表达的机制之间的相互关系，为早期动脉粥样硬化病症的治疗提供理论依据。

1 脂滴的研究

三酰甘油（TG）和胆固醇酯（CE）是人体中主要的中性脂质。由于它们的疏水性，中性脂质不溶于水，自发形成聚集体以使脂质-水界面最小化。脂滴由位于中心的中性脂质如三酰甘油、胆固醇酯和外围包裹的磷脂单分子层构成，之前的蛋白质组学分析已经证明各种来源不同的胞内脂滴（LDs）蛋白质谱[2-3]。此外，在免疫细胞化学分析中，某些LD 蛋白已经明显定位于LD 颗粒上[4]，据报道LD的磷脂组合物不同与肝内质网（ER）的细胞膜[5]。这些观察导致LDs 作为独特的细胞器被广泛接受[6]。

尽管据报道细胞内LDs 无处不在，但是它们的中性脂质成分在细胞和组织类型之间变化。尤其是，单分子LDs 在白色脂肪组织（WAT）中占据相当大部分的胞质溶胶，这是哺乳动物脂肪贮存的部位。尽管肝脏是主要的脂质代谢器官，但在生理条件下存在数量有限。然而，脂肪肝中过量的脂质积累与胞质LDs 的数量和大小相关。在动脉粥样硬化病变中，巨噬细胞源性泡沫细胞从脂蛋白中积累大量的TG 和CE。并且，特定的激素分泌细胞含有胆固醇可以存储脂滴，它可以产生类固醇激素。

2 PAT家族的研究

脂滴相关蛋白存在于脂滴表面，这些蛋白调节着脂滴中脂肪的合成与分解代谢。目前，很多科研学者都热衷于脂滴相关蛋白的研究。adipophilin、Perilipin、TIP47 都能与脂滴结合，以这三个蛋白名字的首字母命名即为“PAT” 家族蛋白。PLIN1 和PLIN2 的N-和C-末端区域以及中央部分是LD定位所需的[7]。另一项最近的研究表明，11-mer 重复形成能够结合胶束和LD 的两亲螺旋[8]。因此，PLIN1-3 的11-mer 重复中的各种点突变改变了两亲性氨基酸比对并消除了LD 缔合。在其他蛋白质，包括载脂蛋白和帕金森氏病蛋白α-突触核蛋白中发现了11 个碱基的重复序列[9]，据报道它可以结合脂质负载的海马神经元中的LD 相关蛋白[10]。

3 PLIN2基因结构和分布特征

众所周知，PLIN2 是主要的肝脏LD 蛋白[11]，PLIN2 基因的CDS 全长为1380bp，编码459 个氨基酸；PLIN2 蛋白推测的氨基酸序列的等电点为6.18，理论分子量为50179.76Da，总平均疏水指数为-0.365，为亲水性蛋白。二级结构共有283 个螺旋、5 个延伸和171 个卷曲结构，存在35 个磷酸化位点，5 个糖基化位点，有3 条跨膜螺旋。它与巨噬细胞源性泡沫细胞，皮脂腺细胞和哺乳动物腺上皮细胞有关，并且它的表达是无处不在[12]。PLIN2最初被命名为脂肪分化相关蛋白（ADRP），反映了它参与诱导早期脂肪细胞分化[13]。然而，PLIN2 存在于未成熟脂肪细胞中，在成熟脂肪细胞分化过程中被 PLIN1 取替[14]。

4 PLIN2 2的表达和调控

有报道发现，当外源性FFA增加时PLIN2 mRNA 表达上调，但体内新生成的FFA 并不会影响PLIN2 mRNA 的表达[15]。因此，当外源性游离脂肪酸过多，肝细胞将触发PLIN2 相关机制使得游离脂肪酸以三酰甘油的形式存储以备将来使用，当外源性FFA 分泌不够时，便会促使合成脂肪酸，并以TG的形式转化为极低密度脂蛋白（VLDL），然后分泌到周边需要TG 的组织中[4]。此外，PLIN2 敲除小鼠对饮食诱导的肥胖，脂肪性肥胖具有抗性，肝脏疾病和酒精引起的脂肪变性，说明了PLIN2 负责脂质积聚，特别是在肝脏中[16-17]。综上所述，这些研究表明PLIN2 促进LD 形成，从而保护TG 免受脂解。

Plin2（adipophilin）基因的表达还受着PPAR的调节，adipophilin 基因启动子上有着PPARs 的调节元件PPRE，在肝细胞中有PPARα 参与调节，而角蛋白细胞中参与调节的则是PPARβ /δ，刘志强等[18]实验室的相关研究显示，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）能激活细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase1/2，ERK1/2）， 抑制 ERK1/2 的活性则会抑制ox-LDL 诱导的adipophilin 和PPARγ的表达，最终抑制脂质蓄积。在RAW264.7 细胞中加入 PPARγ 的抑制剂，抑制 ERK1/2 的活性，使得 adipophilin 的表达升高，并促进细胞内脂质蓄积。 这些结果表明 adipophilin 的表达与 ERK1/2-PPARγ 途径有关[19]。PPAR 敏感的转录因子与类维生素X 受体（RXR）异源二聚化，据报道二十二碳六烯酸（DHA）是RXR 的天然配体[20]。因此，我们证明PPARγ 和RXR 参与了BeWo 人绒毛膜癌细胞中PLIN2 诱导的LD 形成[21]。

先前的研究表明，Plin2 mRNA 表达受PPARs和RXR 调节。但是，细胞PLIN2 蛋白水平与TG储存水平相关。BeWo 细胞在加入DHA 后积累PLIN2 阳性LDs，而用合成的RXR 激动剂治疗增加Plin2 mRNA 表达，但不增加PLIN2 蛋白水平[6]，可能反映了PLIN2 翻译和降解。DHA诱导Plin2m RNA 表达并且可以通过产生TG 稳定PLIN2 蛋白水平，而合成的RXR 激动剂可能不促成TG 合成。巨噬细胞衍生的泡沫细胞在不存在脂质源的条件下培养时具有减少的LD 数量和PLIN2 蛋白质的量。此外，蛋白酶体抑制剂MG132 保护PLIN2 蛋白水平，并导致聚泛素化的PLIN2在巨噬细胞中的积累。类似地，在PLIN2 转染的中国仓鼠卵巢细胞和间充质胚胎成纤维细胞（MEF）衍生的脂肪细胞中证实了泛素介导的PLIN2 的蛋白水解[22]因此，尽管PLIN2 在细胞内脂质含量高的情况下可以稳定LD，但在脂质贫乏的条件下其可能被泛素-蛋白酶体途径降解。在一项相关的研究中，利用转基因小鼠过度表达的蛋白酶体亚基β5t 体内细胞LD积累，调控PLIN2 蛋白酶水解作用的参与[23]。与高脂饮食喂养的野生型小鼠相比，该转基因小鼠显示更弱的蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性和严重的肝脂质积累。虽然在这些转基因小鼠的肝脏中PLIN2含量增加了，但其他一些LD 相关蛋白没有改变。有文献报道以小鼠成骨肌细胞C2C12 敲除PLIN2基因为模型研究脂类代谢以及脂滴表面蛋白的变化，发现PLIN2 基因被沉默后，降低成骨肌细胞合成能力，并减弱水解TAG 的能力。进一步发现，虽然胞内脂滴数目减少，但是脂滴的大小增大，进行形态学观察后发现敲除PLIN2 后，细胞合成PC 和TAG能力显著增强[24]。

Adipophilin 基因不仅受游离脂肪酸和PPAR调节，据报道，中国仓鼠卵巢成纤维细胞经油酸孵育后，PLIN2 蛋白含量增加，当不再用培养液后，发现PLIN2 蛋白表达量降低，蛋白酶体抑制剂MG132可以逆转这种影响，可用脉冲追踪实验来验证MG132 能限制PLIN2 的降解。降解PLIN2 的环境促使泛素改变它的共价键，然而用油酸培育，不仅能使TG 不断积聚还能阻止PLIN2 被泛素化，说明泛素/ 蛋白酶体可以调控PLIN2 翻译后的降解。另有研究表明，在肝细胞中自噬可作为一种额外途径降解PLIN2 和TG 从而促进脂滴分解[25-26]。通过添加3-甲基腺苷抑制自噬或抑制Atg5、Lamp2 蛋白表达可以促进脂质加速积累，说明自噬参与了肝脏中的脂质消耗。另外，有报道指出，在酵母的脂滴中的脂质对于诱导自噬发生是必需的，并且脂质可作为自噬小体的底物[27]。具有基因修饰TG 或固醇酯合成缺少LDs 的酵母中，自噬被抑制。另外，编码TG 和固醇酯的脂肪酶与自噬有关。因此，细胞内脂质合成，降解和储存平衡的过程是相互调节的。在脂肪细胞的成熟过程中，PLIN2 被PLIN1 所取代，但是PLIN2 的mRNA 水平仍然很高，并且降解PLIN2 的蛋白酶体是激活状态的。Takahashi等人认为第2 和第3 个丙氨酸残基对于诱导泛素化的发生以及接下来降解蛋白是必不可少的[28]。在小鼠胚胎成纤维细胞来源的脂肪细胞中，胞质中的PLIN2 容易被降解，而与LD 稳定有关的PLIN2 则不容易降解。

据报道，中性胆固醇酯水解酶（NCEH）是一种微粒体酶，胆固醇酰基转移酶-1（ACAT1），过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）这几种酶均能参与脂质代谢的调控，NCEH 能水解胆固醇酯为长链脂肪酸和游离胆固醇，ACAT1 则与它不同，，它能催化长链脂肪酸和游离胆固醇连接形成胆固固醇酯。另外，由于nCEH 和 ACAT1 与adipophilinn所在区域非常接近，nCEH 抑制脂质积累，ACAT11和 Adipophilin 则相反，它们促进脂质积聚，说明明 adipophilin 与 ACAT1 有协同作用甚至可能结合，adipophilin 可能会与 nCEH 结合并抑制 nCEH 的活活性[28]。在动脉粥样化的诊断中，蛋白激酶C（PKC）磷酸化adipophilin，将PKC 激动剂和THP-1 巨噬噬细胞荷脂共同孵育，可以观察PKC 被激活，同时时可以协同氧化低密度脂蛋白，PPARγ、PKCα 和和adipophilin 表达均上调，极大地加强细胞内脂滴滴的积累[29]。而使用PKC 抑制剂Calphostin C 则会逆转oxLDL 诱导的酶活化和PKCα、PPARγ 和 adipophilin 表达的上调[30]。

5 PLIN2的功能

在脂肪细胞分化初期，PLIN2 蛋白在脂滴表面表达，PLIN2 的mRNA 表达量上升而蛋白表达量降低，脂滴包被蛋白（perilipin）的蛋白表达量和mRNA 也增强，perilipin 蛋白取代 PLIN2 包被于脂脂滴表面，所以PLIN2 蛋白在成熟的脂肪细胞的脂滴表面以及分化后期不表达。敲除PLIN2 基因的小鼠成为了研究PLIN2 在整体水平功能的有力工具，令人意想不到的是，PLIN2 基因敲除后，脂肪细胞的的形态和脂肪组织的重量并没有什么改变[31]。PLIN2基因敲除组小鼠胚胎成纤维细胞（mice embryonic fibroblast，MEF）可以正常诱导分化为脂肪细胞，说明 PLIN2 在脂肪分化过程中作用并不是至关重重要的[32]。有研究认为PLIN2 屏障功能的实现可能是通过阻止酶脂肪细胞甘油三酯脂酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）与的脂滴表面接触[33]。另有文献报道细胞内脂滴的运输机制与水性囊泡的相似，脂滴的融合能被诺考达唑（nocodazole）解聚微管抑制，再用免疫共沉淀的方法去检测PLIN2与动力蛋白（dynein）是否结合，这说明动力蛋白的参与后，脂滴便可以借助微管系统进行运输，而PLIN2 蛋白在介导碎裂脂滴重新融合中的作用至关重要[34]。所以PLIN2 可以主动调控TG，并不是一个被动的保护屏障。

6 展望

就目前研究来看，PLIN2 不仅作为一种特异性性标记物来判断动脉粥样硬化脂质的蓄积程度，对多种代谢性疾病如病理性肥胖、脂肪肝及胰岛素抵抗等都有影响，其表达也受多种因素调控。随着分子生物学研究技术的发展，我们有必要对PLIN2 分子生物学特性进行深入了解，尤其它在调控炎症介质分泌过程中起到什么作用。我们的研究从细胞水平和分子上讨论PLIN2 基因的生物学功能及调控机制，为进一步为PLIN2 基因作为标记基因进行深人而全面的研究提供理论依据。