CMV-IB侵染诱导烟草内质网应激

董文凤，李方方，何青云，肖志新，孙航军，王升平，杨金广，王凤龙，申莉莉*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.云南省烟草公司保山市公司，云南 保山 678000）

内质网（ER）是真核生物细胞中蛋白合成修饰的场所。动物病毒蛋白蓄积使ER腔内稳态失衡，产生内质网应激（ER stress）。细胞首先启动未折叠蛋白应答（UPR），信号因子BiP与ER膜上的前体蛋白[蛋白激酶类内质网激酶（PERK）、需肌醇酶（IRE1）和转录激活因子（ATF6）]解偶联，分别开启蛋白合成控制、蛋白降解和蛋白折叠3条UPR通路恢复内稳态[1-3]。若ER stress持续过长，细胞则转向程序性死亡（PCD），激活凋亡基因，以凋亡或自噬的方式抵御病毒。植物在ER stress诱导剂衣霉素处理下或遭受高温、干旱、盐害、病毒和细菌侵入时产生ER stress[4-5]。拟南芥中已发现高温或衣霉素诱导的两条UPR信号bZIP28和bZIP60，及一条PCD信号NAC089[6-9]，尚未发现PERK路径。水稻OsbZIP50、玉米ZmbZIP60、烟草NtbZIP60均参与UPR，调控寄主的抗性反应[10-12]。

采用荧光蛋白标记单链RNA病毒和ER的方法，在激光共聚焦显微镜下观察到病毒蛋白诱导ER膜形成病毒的复制结构。TMV-GFP侵染本氏烟早期，运动蛋白（MP）和复制酶（RdRp）停泊于ER上聚集成小点状结构，随后ER微管转变成大的聚集体，是病毒复制场所。侵染后期，聚集体又转变成微管，此变化与MP的积累和降解同步[13]。马铃薯Y病毒（PVY）的6K2蛋白诱导ER形成包含6K2在内的病毒复制囊泡[14]。水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的P10蛋白定位于ER膜上，诱导ER形成多孔结构[15]。雀麦花叶病毒（BMV）RNA1编码的复制酶1a蛋白可单独结合在ER外膜上，诱导ER外膜内陷形成内质网小球[16]。此外烟草饰纹病毒（TEV）和马铃薯X病毒（PVX）均在ER内陷的膜结构上复制，但其诱导膜形成的机制尚不清楚[17]。

植物病毒侵染还诱导ER stress相关的UPR信号bZIP60[18]，如PVX侵染本氏烟3 d，UPR基因（BiP、bZIP60和SKP1）转录水平提高3倍，过表达BiP缓解ER stress相关的PCD症状。TMV-TGBp3接种本氏烟，UPR基因在8 h内上调15～35倍，在出现PCD前下降；过表达BiP抑制PCD，显示UPR是居前的生存机制[19]。RBSDV侵染本氏烟和水稻原生质体2 d，其P10触发BiP、bZIP60、PDI、CAM表达上调2.5～3.5倍[15]。GarVX侵染本氏烟3 d，bZIP60和BiP表达上调9.5～10.6倍[20]。

此外，在TMV侵染含N基因的转基因烟草产生的枯斑及其临近健康细胞的胞质和液泡中，观察到包裹胞质和细胞器的双层膜自噬泡，及自噬小体与液泡逐渐融合的过程，说明N基因介导的抗TMV的过敏性坏死反应（HR）诱发了细胞自噬[21]。TMV侵染海拉细胞时，TMV-RNA在ER膜上被翻译成MP，+RNA从细胞质转移到细胞核，同时BiP表达上调；病毒蛋白在自噬小泡膜上积累，形成的自噬小泡与ER膜扩大密切相关。显示海拉细胞用ER stress及自噬来抵御TMV[22]。利用透射电镜和自噬基因ATG8-GFP瞬时表达技术，证明TMV侵染诱导烟草细胞自噬[23]。

为明确利用液泡膜复制的三分体RNA病毒CMV是否诱导寄主ER stress，本文在CMV-IB侵染三生烟和本氏烟体系中，进行了qRT-PCR检测ER stress相关基因的转录激活，农杆菌介导的ER marker（ER-mCherry）瞬时转染后激光共聚焦观察ER形态，以及电镜观察细胞自噬结构的研究。

1 材料与方法

1.1 供试烟草、病毒和载体

三生烟（N.tabacumcv.Samsun NN）、本氏烟（N.benthamiana）；CMV-IB株系；Fu46-RFP入门载体、pEarlyGate100表达载体、pEasy®-T1克隆载体。

1.2 试验设计

CMV提纯采用PEG法[24]。试验设2个处理，即4叶期植株分别摩擦接种CMV或磷酸缓冲液（PBS）对照。每处理48株，25℃/16 h光照培养。

接种后0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、6 d、9 d，每时间点每处理选取4株，每株取相同叶位接种叶1片，于液氮中迅速冷冻，−70℃保存，备RNA提取和qRT-PCR检测。

接种后0 h、24 h、72 h、6 d，各处理分别取无擦伤接种叶1片，用手术刀切下 2 mm×1 mm的小块（避开叶脉正方形四点取样），放入1.5 mL离心管中，加2.5%戊二醛固定，抽真空后4℃冰箱贮藏，备电镜样品制备。

接种后3 d、5 d、8 d、12 d，每处理选择3株，在接种叶和新叶上浸润注射ER-marker（mCherry-HDEL），48 h后在激光共聚焦显微镜下观察ER形态。

1.3 CMV CP及ER stress相关基因检测

1.3.1 引物设计 根据CMV-IB株系的CP序列和中国烟草基因组数据库（http://218.28.140.17/）中各基因的CDS，采用Primer5.0软件设计荧光定量引物（表1）。

1.3.2 qRT-PCR检测 Trizol法提取叶片总RNA后，于Thermo微量核酸紫外分析仪上检测RNA浓度和纯度。一步法合成第一链cDNA且去除gDNA。采用SYBR在ABI7500上进行qRT-PCR反应。用相对CT法公式2-∆∆CT，以Actin为内参，以0 h样品的CT值为标准1，计算各取样点的相对RNA积累量[19,25]。

1.4 电镜样品制备及观察

样品经固定、脱水、包埋、烘干、切片和染色后，在JEM-1200EX型透射电镜下观察[26]。拍照记录病毒粒体分布及叶绿体、线粒体、液泡等细胞器形态。

1.5 ER marker标记及形态观察

1.5.1 引物设计 根据Fu46-RFP入门载体上RFP序列合成带有寡聚核苷酸序列的引物对ER signal F/R和带有HDEL序列的引物对RFP F/R（表2）。

1.5.2 ER-marker（mCherry-HDEL）质粒构建 人工合成两条含有ER信号肽序列的oligo DNA（ER signal F/R），退火形成双链DNA后与用HindIII和EcoRІ双酶切的载体（Fu46-RFP）连接构成重组质粒（pSP-Fu46-RFP），并转化至大肠杆菌中，检测阳性克隆。以RFP F/R引物对（反向引物带有HDEL，表2）从pSP-Fu46-RFP中扩增RFP，回收产物并与用EcoRІ和SacІ双酶切的SP-Fu46-RFP连接构成重组质粒SP-Fu46-RFP-HDEL，转化至大肠杆菌中，检测阳性克隆。利用LR反应将目的基因重组至表达载体pEarleyGate 100中，构成ER marker（mCherry-HDEL）[26]。

1.5.3 农杆菌浸润瞬时转染和激光共聚焦显微观察 将重组质粒转化至LBA4404农杆菌感受态细胞中，28℃过夜培养。离心收集菌体，用缓冲液（含10 mmol/L MgCl2，pH=5.5 10 mmol/L MES，200 μmol/LAS）悬浮，调节至OD600nm=0.6，25 ℃孵育4 h。用针头在叶背刺一微伤口，将悬液加入去针头的注射器，拇指顶住叶片，从伤口处注射入叶片。26℃培养48 h，在激光共聚焦显微镜下观察荧光信号。RFP的激发波长为552 nm，接收波长为570～620 nm[15,26]。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 List of quantitative RT-PCR primers of N.tabacum and N.benthamiana

表2 内质网ER Marker（mCherry-HDEL）引物Table 2 List of primers used to ER-RFP

2 结果

2.1 CMV-IB系统侵染三生烟和本氏烟

提纯的CMV-IB（50 μg/mL）摩擦接种三生烟，第5天接种叶表现脉明，随后出现花叶和绿岛症状。第10天新叶表现脉明和花叶症状，第14天新叶呈现黄绿相间的花叶狭长症状，第18天接种叶表现橡叶纹状坏死。CMV-IB在本氏烟上也表现系统感染症状，心叶呈现皱缩、扭曲和畸形症状，植株矮化（图1）。

图1 CMV-IB在三生烟（A）和本氏烟（B）上的症状Fig.1 Symptoms of CMV-ІB on N.tabacum cv.Samsun NN(A)and N.benthamiana（B）

在Thermol微量核酸紫外分析仪上检测提取的RNA，显示样品纯度为A260/280比值为 1.99～2.08，A260/230比值为1.46～1.93，样品的纯度和浓度符合qRT-PCR的要求。配制qRT-PCR反应体系，检测CMV CP转录水平，结果显示，三生烟和本氏烟在接种CMV后第3天检测到外壳蛋白RNA，随后逐渐升高，第6天达到峰值，然后进入平台期（图2）。

2.2 CMV-IB侵染激活寄主ER stress相关基因的表达

采用qRT-PCR检测7个ER stress相关基因（BiP、CAM、PDI、SKP1、bZIP60、bZIP28、NAC089）的转录水平。三生烟上的结果显示，与0 h（未接种）相比，接种CMV的处理UPR基因在6～12 h表达量显著提高，其中BiP、CAM、PDI和SKP1在12 h的相对表达量RQ值分别达到35.36、62.65、15.60和10.55；PCD基因NAC089在48～72 h表达量显著提高。PBS对照处理的ER stress相关基因变化较小。与PBS对照相比，UPR基因的表达在接种CMV后6 h提高了2.64～5.18倍，接种后12 h提高了2.30～7.37倍；PCD基因NAC089则在48 h和72 h表达量分别提高了1.96倍和2.09倍（图3）。

在本氏烟上检测到相同趋势的试验结果。即：与PBS对照相比，UPR基因在接种CMV后12 h显著上调1.25～4.21倍，PCD基因NAC089在48 h提高2.15倍，与坏死相关的基因SKP1在72 h提高1.88倍（图4）。上述试验结果表明，CMV侵染激活了ER stress相关的转录信号，且UPR是居前的信号。

图2 CMV CP在三生烟(A)和本氏烟(B)接种叶内的积累Fig.2 CMV CP expression in inoculated leaves conducted by qRT-PCR

图3 三生烟接种CMV较PBS对照ER stress基因的表达差异Fig.3 Upregulation of ER stress genes in CMV infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

图4 本氏烟接种CMV较PBS对照ERstress基因的表达差异Fig.4 Upregulation of ER stress genes in CMV infected N.benthamiana leaves

2.3 CMV-IB侵染烟草的细胞病变

2.3.1 CMV-IB侵染导致细胞器降解 采用电子显微镜观察CMV侵染的三生烟细胞，结果显示，相对于正常细胞，病变细胞的液泡增多，细胞质中布满CMV粒子，胞间连丝呈扩张状，附近分散有病毒粒子（图5A）。病变细胞的线粒体肿胀，膜完整性被破坏（图5B）。病变严重的细胞出现叶绿体降解，内中的淀粉粒和脊上的片层结构畸形（图5C）。过氧化物酶体周围布满病毒粒子，但在对照和CMV侵染的细胞中均出现过氧化物酶体的晶格排列（图6A）。正常细胞其细胞核位于细胞质中，核膜完整，而CMV侵染的细胞其细胞核游离于细胞质，核膜开始破裂（图6B）。在液泡膜边缘出现小的囊泡状结构，伴随分布大量的病毒粒子。中空细胞的液泡中出现丝状链接的降解结构，甚至空泡化，即细胞质缺失，细胞器降解（图6C）。

CMV侵染本氏烟亦导致线粒体和叶绿体膜完整性损坏，周围布满病毒粒子（图7）。上述结果显示CMV侵染烟草导致显著的细胞病理性病变，病毒粒子逐渐遍布于细胞质、液泡周围及胞间连丝处；各亚细胞器的完整膜结构丧失、内部结构逐渐降解；侵染后期随病毒粒子的增多，细胞器完全降解，病变严重的细胞出现空泡化凋亡。

2.3.2 CMV-IB侵染诱发自噬结构 电镜下观察CMV侵染三生烟前期（24～72 h）和后期（6～9 d）的叶片细胞，结果显示，在侵染早期，细胞中未观察到病毒粒子，沿液泡膜出现不同时期的内陷的膜状结构，直径约300 nm，内中包裹着大小不等的双层膜的囊泡（图8A）。在侵染后期，细胞中布满病毒粒子，细胞质中出现较大的双层膜状结构，直径约1～3 μm，内中有典型的水解性液泡（pre lytic vacuole，pre-LV）、坍塌的液泡膜（collapsed vacuole membrane，cVM）和中心自噬泡（autophagic vacuole，AV）。大量的病毒粒子聚集在此种结构周围（图8B）。在CMV侵染本氏烟的叶片细胞中也观察到上述两种囊泡结构（图9）。

图5 CMV侵染三生烟的病毒分布（A）、线粒体病变（B）和叶绿体降解（C）Fig.5 The virus distribution(A),mitochondria swelling(B),and chloroplasts degraded(C)in CMV infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

图6 CMV侵染三生烟的过氧化物酶体病变（A）、细胞核游离（B）及病毒性小囊泡和降解泡（C）Fig.6 The peroxisomes lesion(A),nucleus dissociated(B),virus associated vesicae and degraded structures(C)in CMV infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

图7 CMV侵染本氏烟的病毒分布（A）、叶绿体和线粒体病变（B）Fig.7 The virus distribution(A),mitochondria swelling,and chloroplasts degraded(B)in CMV infected N.benthamiana leaves

图8 CMV侵染三生烟诱发微自噬和巨自噬结构Fig.8 The microautophagy and macroautophagic structures in CMV infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

图9 CMV侵染本氏烟诱发微自噬和巨自噬结构Fig.9 The microautophagy and macroautophagic structures in CMV infected N.benthamiana leaves

根据Van Doom和Papini（2013）有关植物体中自噬结构的描述，上述两种复合囊泡状结构分别为发生在液泡膜边缘的微自噬和发生在细胞质中的巨自噬[27]，文中还描述了过氧化物酶体、线粒体等细胞器自噬。本文发现在CMV侵染的细胞中，自噬结构显著增加，在侵染后期的一些细胞中，细胞器降解和细胞空泡化凋亡普遍。

2.4 CMV-IB侵染烟草诱发ER形态变化

采用农杆菌介导的瞬时转染在预先接种CMV的叶片细胞中表达ERmarker（mCherry-HDEL）48 h，激光共聚焦显微镜下观察发现：PBS对照处理中，RFP的表达呈现典型清晰的ER网状结构。而接种CMV后5 d，ER网状微丝出现增生，形成沿微丝的逐渐增大的囊泡状。第10天呈现红色小囊泡状结构，类似于包被蛋白复合囊泡（coat protein complex П vesicles，COPП）。侵染后期（15 d）增生聚集的囊泡又逐渐恢复成ER的网状微丝结构，但部分区域仍清晰可见小囊泡状结构（图10）。

本氏烟在接种CMV后5～7 d，ER的网状微丝逐渐增厚，形成囊泡；到第10天增生现象更为显著，第15天逐渐恢复成网状微丝结构。在接种叶上部表现花叶症状的新叶中，既观察到ER增生现象又有ER的典型网状结构（图11）。ER的这种形态变化说明在CMV初侵染和系统侵染的细胞中，ER的网状微丝经历了膜重排和膜恢复的过程。

3 讨论

3.1 CMV-IB系统侵染烟草

CMV根据血清学和基因组序列差异可分为І亚组和II亚组，II亚组流行于热带和亚热带，症状较重；І亚组主要流行于温带，其中ІA株系导致豇豆（Vigna unguiculata）系统花叶症状，而ІB株系则产生局部坏死症状[28]。ІB株系侵染烟草，产生较重的花叶和畸形症状，干旱条件下出现橡叶纹状坏死[29]。本文显示CMV-ІB系统侵染三生烟和本氏烟，表现花叶、畸形和橡叶纹症状；接种后3 d可检测到子代病毒，第6天达到增殖高峰。之前报道CMV-Y株系在22～28℃接种珊西烟（N.tabacumcv.Xanthi nc）后1 d能检测到子代病毒，第3天达到复制高峰[30]。应是病毒株系、培养温度和寄主生育期的不同，造成CMV积累量的不同，表现为不同的初始检出点和高峰点。

图10 CMV诱导三生烟ER膜增生和重排Fig.10 The membrane rearrangements of ER noted by circle in epidemis cells of CMV-infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

图11 CMV诱导本氏烟ER膜增生和重排Fig.11 The membrane rearrangements of ER noted by circle in epidemis cells of CMV-infected N.benthamiana leaves

3.2 病毒激活寄主ER stress相关基因

研究表明，RBSTV P10，PVX TGBp3和GarVX p11侵染本氏烟后2 d，诱导ER stress伴侣蛋白BiP和UPR信号因子NbbZIP60等转录水平上调约3倍[15,19-20]。重组病毒TMV-TGBp3或TMV-p11侵染本氏烟，不仅诱导UPR基因显著上调，且产生UPR相关的PCD症状[19-20]。

本文显示UPR基因（BiP，CAM，PDI，bZIP28和bZIP60）在接种CMV后6～12 h被显著诱导上调，PCD基因NAC089则在48～72 h显著被诱导，表明CMV侵染激活了ER stress相关的信号，且UPR是居前的信号通路。

3.3 病毒诱发寄主ER膜重排和增生

ER参与很多RNA病毒的复制、转运和组装，如TMV、BMV和PVY诱导ER膜形态发生巨大改变，形成复制的布袋结构或球形凹陷结构[13,16,19]。最近研究表明RBSTV P10，PVX TGBp3和GarVX p11侵染本氏烟，也诱导ER膜结构重排和增生[15,19-20]。

本文通过构建ER marker（mCherry-HDEL）经农杆菌介导瞬时转染，在激光共聚焦显微镜下观察到CMV侵染后，ER膜明显增生，在侵染早期逐渐形成囊泡状的点状结构，侵染后期又恢复成清晰的网状微丝结构。在表现花叶的新叶中，ER的清晰微丝与增生囊泡共存。这说明，虽然CMV不在ER膜上复制，但ER参与病毒的复制，经历了巨大的形态改变。此外，形成的这些囊泡状结构类似于包被蛋白复合囊泡COPII。研究表明COPII参与TMV的胞内转运；且在ER膜蛋白AtbZIP28从ER到Golgi的输出中发挥重要作用[31]。

3.4 CMV侵染烟草导致细胞器降解和自噬结构增多

在CMV侵染的病变细胞中，观察到叶绿体畸形，片层结构解离；线粒体肿胀，膜结构被破坏；液泡增多。这些细胞器的病变与之前报道的CMV侵染烟草的细胞病理相似[32]。过氧化物酶体中有序排列的晶体结构、叶绿体中类囊体膜结构对称性的丧失，在CMV（Y-GM2）侵染心叶烟（N.Glutinosa）中也报道过[27]。

重要的是，在侵染前期的细胞中，沿液泡膜内陷形成内中包裹小的双层膜结构的复合囊泡；侵染后期在布满病毒粒子的细胞质中，还出现另一种包裹中心自噬泡的复合囊泡。根据TMV侵染含N基因的转基因烟草诱导寄主细胞自噬和植物细胞中自噬结构的描述[21,23]，显示我们观测到了CMV侵染烟草诱发的寄主细胞微自噬和巨自噬。

上述细胞器降解初期和巨自噬结构均伴随着大量病毒粒子，而病变严重的空泡细胞中未观察到病毒粒子，暗示CMV侵染烟草造成的细胞器降解和自噬结构增多与寄主的基础抗性反应密切相关。

此外，沿液泡膜外缘不仅分布大量病毒粒子，且出现一些小的囊泡状结构，这可能是病毒的复制结构。洪健等[32]在CMV侵染心叶烟的细胞中，也观察到此种沿液泡膜分布的伴随病毒粒子出现的病毒性小泡。CILLO等[33]通过免疫胶体金电镜，观察到病毒的复制酶蛋白1a和2a主要分布在液泡膜周围，显示CMV利用液泡膜进行病毒增殖。

CMV在液泡膜上复制后，是如何转运到胞间连丝处？ER膜上增生的类似COPП的囊泡状结构，是CMV胞内转运的载体，还是参与ER腔蛋白NbbZIP28的输出[31]，尚需通过CMV的侵染性克隆及其与液泡和内质网的互作，以及NbbZIP28蛋白从ER到Golgi的转运过程加以确认。

4 结论

本文研究表明，CMV-ІB系统侵染三生烟和本氏烟，表现ІB株系的典型花叶和畸形症状。CMV侵染通过激活ER stress相关基因和诱导ER膜结构增生、重排而引起寄主细胞内质网应激。寄主细胞会以微自噬、巨自噬及细胞器降解的方式抵御病毒侵染，严重者表现为细胞空泡化凋亡，导致寄主叶片组织坏死。

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