烟叶落黄过程中烟碱代谢规律及相关基因表达分析

张震彪，李 伟，杜咏梅，张海良，刘 成，李晓旭，郭永峰*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

烟碱是重要的氮素化合物，其含量高低直接影响烟叶品质及香味，培育适宜烟碱含量的烟草品种，提高烟叶质量、降低卷烟制品对健康的危害一直是生产上追求的目标[1]；了解烟叶落黄过程中烟碱代谢规律及基因表达变化，对改良烟草品质、指导烟草农业生产具有重要意义[2]。

烟碱是生物碱中最主要成分，其干重占90%以上[3]，烟碱合成部位为植物根部，利用维管组织运输至叶片中，储存于植物叶片的液泡[4]。目前烟碱合成机制已基本阐明，包括吡咯环和吡啶环的形成、两环的缩合。吡咯环和吡啶环合成较复杂，需经历多个酶促反应，如精氨酸脱羧酶（argininedecarboxylase,ADC)催化精氨酸形成腐胺[5]，腐胺在腐胺-N-甲基转移酶（putrescineN-methyltransferase,PMT）作用下形成N-甲基腐胺（N-methyltransferase）[6]，N-甲基腐胺氧化酶（N-methyltransferase oxidase，MPO）氧化N-甲基腐胺形成4-甲氨基丁醚[7]等，而吡啶环生成需要喹啉酸合成酶（quinolinate synthase,QS）、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase,QPT)的参与[5,8]，最终两环在黄酮还原酶A622和小檗碱桥连酶BBL的作用下缩合形成烟碱[9-10]，目前两环缩合的机制仍未知，参与缩合的烟碱合成酶基因尚未被克隆。

烟叶成熟衰老过程中，烟碱发生去甲基化而转化成降烟碱，其中CYP82E4v1是该过程的重要调控因子[11]，进一步研究证实CYP82E5v2、CYP82E2和CYP82E10也参与此反应[12]，不同的是CYP82E4v1在衰老组织中表达活跃，而CYP82E5v2主要在未衰老的组织中表达。衰老后期烟叶中的烟碱含量升高，其中JAT1、MATE和NUP1蛋白发挥重要转运功能，JAT1、MATE主要位于液泡膜上，负责将胞质内烟碱转运至液泡内，而NUP1定位于质膜，主要运输胞质外烟碱至胞内，此外NUP1具有很强的特异性，不能转运新烟碱和降烟碱[13]。烟碱合成过程受植物激素调控，如茉莉酸、生长素、乙烯等[6]，茉莉酸能够激活烟碱合成基因的表达，而生长素和乙烯是烟碱合成的负调控因子，抑制烟碱的合成；同时，COI1和JAZ1以及肌醇戊基磷酸分子组成的茉莉酸受体复合体能够感知并应答茉莉酸信号，改变烟碱合成基因的转录活性，影响烟碱合成[14]；此外，转录因子ERF32、ORC1、bHLH1/2和MYC2等通过介导JA途径也参与调控烟碱代谢[15-17]。

烟草作为生物学研究的模式植物，其烟碱合成、遗传调控及转运机制已基本阐明，代谢途径相关基因、重要调控因子和转运蛋白均已被克隆和鉴定，而烟叶落黄衰老过程中烟碱代谢变化及相关基因表达规律尚未明确；本试验以普通烟草红花大金元为材料，选取打顶后15、25、35、45、55、65、75、85 d中部叶片，分析打顶后不同衰老时期烟叶生物碱的含量变化；利用该样品已测定的转录组数据，分析烟碱代谢相关基因表达模式；对15、45、55、75 d的样品进行烟碱代谢相关基因定量分析，验证转录组数据；为进一步解析烟草烟碱代谢调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

供试材料：普通烟草（Nicotiana tabacum）红花大金元，由中国农业科学院烟草研究所种质资源中心提供。

试验试剂：RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR®Fast qPCR Mix均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 2013年3月温室播种，4片真叶时假植，8片真叶移栽至大田，以中部叶（自下而上第9～10片）为研究对象，烟株打顶后15 d第1次取样，以后每隔10天取样1次，共计8次，分别代表不同衰老程度的烟草叶片。取样时选择生长状态一致的植株，在相同叶位每株仅取1次，选取12个单株为一次样品采集，每3株混合为一个样本，4次生物学重复。收取的每个叶片以主叶脉为界一分为二，分别用于生物碱含量测定和RNA提取，液氮速冻后-80℃保存。

1.2.2 生物碱含量测定 将烟草叶片液氮研磨至细粉末状，冷冻干燥48 h，采用气相色谱-质谱联用法测定样品中生物碱的含量，主要包括烟碱、去甲基烟碱、新烟草碱、麦斯明，以国标为参照进行。

1.2.3 转录组分析烟碱代谢相关基因 查阅相关文献，在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索烟碱代谢相关基因序列，分别比对中国烟草基因组数据库（未公开发表），提取基因ID；根据本实验室已有的烟草叶片衰老转录组数据，从差异表达基因（|log2|≥1，p≤0.05）中筛选ID号，结果见表1，提取烟碱代谢相关基因转录组数据，利用热图绘制软件GSP，Heml绘制基因表达热图，将表达数据可视化。（注：实验室已有的转录组数据即为本次试验所用材料的转录组测序结果，转录组测序由华大基因完成）。

1.2.4 Real-Time PCR验证烟碱代谢基因表达数据烟草叶片总RNA提取，参照宝生物RNAiso Plus（Total RNA提取试剂）试剂盒说明书进行，凝胶电泳和超微量分光光度计检测RNA的质量和浓度，宝生物提供的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)用于RT-PCR反应，将合成的cDNA稀释10倍，常规PCR检测cDNA质量，选取高质量cDNA为模板，定量分析烟碱代谢基因表达变化。

利用Premier Prime5.0软件设计烟碱代谢相关基因的定量PCR引物（表1）。选用打顶后15、45、55、75 d叶片cDNA为模板，ABI 7500型实时荧光定量PCR仪进行Real-Time PCR反应，3次技术重复，以打顶后15 d的叶片为单位1，采用2−ΔΔCt法计算基因的相对表达量，SPSS 22.0进行方差分析。

2 结果

2.1 烟草不同衰老时期叶片中生物碱含量分析

不同衰老时期叶片中生物碱含量（烟碱、去甲基烟碱、新烟草碱、麦斯明）如图1所示。可以看出，烟草衰老成熟过程中，叶片中生物碱各组分呈现上升趋势，包括烟碱、新烟草碱、去甲基碱、麦斯明；衰老后期（75或85 d时），新烟草碱含量上升最明显，增加了123.7%，烟碱、去甲基碱含量也有明显提高，分别增加54.2%和42.7%，而麦斯明含量只有18.5%的提高，以上结果显示叶片中生物碱含量随着烟叶成熟衰老逐步积累。

2.2 叶片烟碱代谢基因表达分析

根据转录组测序结果，检索烟碱代谢相关基因表达数据，利用相应的生物信息学软件绘制基因表达差异图（图2）。共检索到43个烟碱代谢相关基因，涉及烟碱合成、降解、转运、以及遗传调控等过程。图2显示，随着烟叶成熟衰老，烟碱降解相关基因CYP82E2、CYP82E4上调表达，其中CYP82E2表达量上升6.2倍，CYP82E4上升2.9倍，而CYP82E10、CYP82E5v2表达量变化不大；烟碱合成基因主要包括ADC、ODC、BBL、MPO、QS、SPDS及其同源基因，其中BBL2表达量上调2.9倍，ODC2上调2.7倍，ADC1略上调，其他基因表达变化不明显；烟碱转运相关基因分别是JAT1、MATE2、NUP1，其中JAT1在衰老后期上调最明显，表达量提高2.6倍，NUP1的表达模式类似于MATE2，在65 d时最高；烟碱代谢调控基因较多，包括COI、MYC、ORC、JAZ、MTHFR1、ERF32及其同源基因，其中COI2、COI3、MYC2、MYC3、JAZ1上调表达，而JAZ1、MYC2上调最明显，约2.3倍，下调基因有MTHFR1、ORC3，其余基因未有明显变化。图2中基因表达变化说明烟碱代谢是通过多个基因协同调控实现的，相关基因表达变化趋势同衰老叶片中烟碱、降烟碱含量变化规律基本一致。

表1 引物目录Table1 Primers

图1 打顶后不同时期叶片中的生物碱含量Fig.1 Alkaloid contents in leaves at different time points after topping

图2 烟碱代谢相关基因的表达数据分析Fig.2 Expression of genes related to nicotine metabolism

2.3 Real-Time PCR表达数据分析

选取烟碱代谢关键基因（表1），以打顶后15、45、55、75 d叶片cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，验证转录组数据，结果如表2所示。定量PCR结果显示，调控基因CYP82E4、CYP82E2在叶片衰老后期上调表达，75 d时表达量增加10.7倍；转运蛋白基因JAT1在55 d时上调8.87倍，而NUP1在45 d时上调3.37倍，可能这一时期烟碱运输活性最强；合成基因ADC1、ODC2、BBL2也呈现上调趋势，且55 d时表达量达分别提高2.41、16.2和6.49倍，预示着叶片器官也可能参与了烟碱的合成；调控基因COI1、MYC3在55 d时表达量上升至15 d的13.8倍和3.77倍，JAZ1、MYC2在整个衰老时期上调表达，75 d时表达量分别增加3.5倍和4.55倍，MTHFR1下调显著，75 d时表达量下降到原来的0.238倍，而ORC1变化不明显；以上定量分析与本试验转录组测序结果基本一致，表明转录组测序结果能够真实地反映烟碱代谢相关基因的表达情况，这为烟碱代谢功能基因的发掘提供了有利的参考。

表2 烟碱主要代谢基因qRT-PCR验证分析Table 2 Real-Time PCR verification of gene expression in nicotine metabolism

3 讨论

烟碱合成的根特异性机制认为，根部器官是烟碱合成的唯一部位，其他组织器官不具备合成烟碱的能力[5]；在衰老成熟过程中，参与烟碱转运的蛋白基因JAT1、NUP1表达上调，NUP1将根部的烟碱运输至叶片器官，再由JAT1转运至液泡内，从而使叶片中的烟碱含量增加，但转录组测序及定量验证结果显示，ADC1、ODC2、BBL2等烟碱合成基因在叶片衰老过程中表达水平明显提高，暗示叶片中有可能存在某几个烟碱合成催化反应，如通过ADC1、ODC2促进吡咯环生物合成或BBL2催化两环的缩合途径实现烟碱含量持续增加，促进成熟叶片中的烟碱合成，但衰老叶片中是否存在烟碱合成还需进一步验证；生物碱含量分析结果表明，除烟碱外，其他生物碱及代谢中间产物如新烟草碱、降烟碱、麦斯明等在衰老叶片中不断积累，而转录组和定量PCR分析结果显示，烟碱转化基因CYP82E2、CYP82E4表达持续增加，推测烟碱向降烟碱的转化主要通过CYP82E2、CYP82E4途径来实现。

烟碱代谢是一个极其复杂的生物学过程，多个因子协同调节基因变化最终影响叶片中的烟碱含量。COI1蛋白能够响应JA信号，在26S蛋白酶体的作用下靶向降解JAZ蛋白，JAZ蛋白表达水平下降，从而激活JA响应基因的转录[14]，但转录组测序和定量验证结果显示，衰老后期JAZ1上调表达，说明衰老介导JAZ1调控烟碱合成途径不同于JA，其调控机制有待于进一步研究；MTHFR1通常作为CYP82E4的转录抑制因子调控CYP82E4的转录[6]，试验结果显示，叶片衰老过程中，MTHFR1表达量降低，对CYP82E4的抑制作用减弱，从而使CYP82E4转录水平提高，有利于烟碱向降烟碱方向的转化，这与之前的研究基本一致；ORC1过表达能提高烟碱的含量[16]，但ORC1调控烟碱合成的机制尚不清楚，目前有研究指出ORC1响应MeJA信号途经，通过磷酸化途径激活烟碱合成基因表达，定量分析结果显示，ORC1在整个衰老过程中表达略微下调，表明除了转录水平外，衰老介导ORC1调控烟碱合成途径可能也有磷酸化过程的参与。

植物体内的烟碱含量受环境因素影响，在一定范围温度能促进叶片中烟碱积累[18]，肖金香等[19]对气候生态因素影响烤烟品质的研究中发现，气温每上升1℃，烟碱可提高3.59 g/kg；金云峰等[18]研究发现，成熟期生物碱的积累水平与生长温度呈正相关关系，温度上升能促进烟碱向叶片中的转移；与此相一致地，本试验发现自然衰老的烟叶中烟碱含量稳定上升，推测这一过程可能与植物所受温度有关。不同栽培措施如打顶抹杈、施肥等对烟碱含量也有很大影响[2,20-21]，生产上打顶能促进烟碱向叶部的转移[22]，而氮肥能极大地提高烟碱的生物合成。不同的环境因素和栽培措施影响烟碱代谢的机制目前尚未弄清，猜测可能影响了烟碱合成或转运的关键酶基因表达而改变叶片烟碱含量，这一假设需要进一步验证。

4 结论

试验结果表明，烟草叶片成熟过程中生物碱含量不断增加，包括烟碱、去甲基烟碱、新烟草碱、麦斯明；而烟碱作为生物碱最主要的部分，其含量在衰老过程中不断提高。与烟碱含量增加相符的是，在烟叶衰老过程中，一些与烟碱运输相关的蛋白基因上调表达，例如JAT1、NUP1等。同时进入衰老期后，叶片中烟碱合成代谢基因表达量增加，例如ADC1、ODC2、BBL2及其同源基因，暗示着衰老后期叶片中可能存在烟碱合成。调控烟碱代谢相关基因COI1、JAZ1、MYC2、MYC3表达上调，MTHFR1下调，表明叶片中的烟碱代谢是由多个因子协同调节完成的，存在复杂的调控网络机制。本研究通过分析烟草衰老叶片烟碱代谢相关基因表达情况，探究烟叶成熟衰老过程烟碱代谢变化规律，为生产上改良烟叶品质、选育优良品种及减轻卷烟制品对健康的危害提供了理论参考。

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