钙果仁活性肽的制备及其体内抗氧化活性评价

张玲 郝利平

摘要：利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶对钙果仁蛋白进行三酶复合分步水解制备活性肽，通过给正常小鼠和模型鼠灌胃不同剂量的钙果仁活性肽来研究其对试验小鼠的抗氧化作用。结果表明，经三酶水解后的钙果仁活性肽有较好的清除DPPH·自由基能力，其IC50值为1.06 mg/mL。另外，活性肽高剂量组还能够显著提高正常小鼠以及模型鼠血清、肝脏和肾脏中SOD和GSH-PX的活力，同时可显著降低其血清和肝脏中MDA的含量，但对降低肾脏中MDA的含量作用不显著，说明钙果仁活性肽可清除自由基对机体的损害，在小鼠体内有一定的抗氧化作用。

关键词：钙果仁;酶解;DPPH·自由基;抗氧化作用

中图分类号：R282        文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）21-0101-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.025           開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Preparation of Cerasus humilis Kernel Peptide and Assessment of

the Antioxidant Activity in vivo

ZHANG Ling1，HAO Li-ping2

（1.Shanxi Agricultural Science Academy， Processing Institute，Taiyuan 030031，China;

2.Shanxi Agricultural University，Food Science and Engineer College，Taigu 030801，Shanxi，China）

Abstract： Kernel of Cerasus humilis protein were hydrolyzed by three kinds of enzymes including alkaline protease， trypsin and neutral proteinase. Kernel of Cerasus humilis peptide of different concentrations were gaved in the mice. Determined the antioxidant of the normal mice and model mice by analyzing the body weight，the SOD activity，the GSH-PX activity and the MDA concentration in serum，liver and kidney of mice. Results suggest that the kernel of Cerasus Humilis peptides had a relatively high level of DPPH radical scavenging activity with the IC50 value was 1.06 mg/mL. The high dose peptide could significantly increase the SOD and GSH-PX activity in serum，liver and kidney and could significantly reduce the concentration of MDA in serum，liver （P<0.05），but the effect on MDA in kidney was not significantly.

Key words： kernel of Cerasus Humilis; hydrolysis; DPPH free radical; antioxidant activity

钙果仁为蔷薇科樱桃属欧李（Cerasus humilis）的种子，欧李是中国特有的一个古老野生灌木果树树种，其果实富含矿质营养，钙含量较高，故又名钙果，主要分布在中国辽宁、内蒙古、河北等地，是果药兼用的野生树种，原产中国三北地区，其茎叶、果实、根皮具有很高的经济利用和药用价值[1]。钙果仁也是中国医书中记载的一种常用药郁李仁，可润燥滑肠、下气、利水。用于治疗津枯肠燥、食积气滞、腹胀便秘、水肿、脚气、小便不利等病症[2]。近年来人工培育的钙果果实的开发应用及深加工多集中于果汁、果脯、红色素等的制备[3]。果实加工后会产生大量的钙果仁，目前已有对钙果仁保健油提取分离[4]的研究，但对其蛋白质的利用和研究较少[5]，而果仁蛋白质含量远高于杏仁、扁桃仁、核桃中蛋白质的含量[6]，且蛋白质经水解可以得到具有多种生物活性功能的肽物质。目前，可食性植物源抗氧化肽因其优越的抗氧化活性和较高的安全性，有其独特的生理功能和广泛的应用前景[7]。本试验以钙果仁为原料制备活性肽并研究其对小鼠体内相关酶系和脂质氧化的影响，为植物蛋白制备活性肽以及活性肽体内抗氧化作用的评价提供一定的理论依据，同时也对天然抗氧化剂的应用与开发，以及蛋白质资源的综合利用提供理论基础及技术支撑。

1  材料与方法

1.1  材料

钙果仁，山西农业大学果园提供。钙果仁蛋白粉，山西省农业科学院农产品加工研究所果蔬加工实验室制备。昆明种小鼠，雄性，80只，体重20 g左右，购自山西医科大学。

1.2  主要试剂与仪器

蛋白酶（北京奥博星生物技术有限责任公司）;DPPH·自由基（Sigma公司产品）;总超氧化物歧化酶测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）;FSH-I型高速电动匀浆机;LD5-10型低速离心机;紫外可见分光光度计。

1.3  试验方法

1.3.1  钙果仁活性肽的制备  钙果仁蛋白酶酶解条件如表1所示。

1.3.2  活性肽对DPPH·自由基清除率的比较  活性肽对DPPH·自由基清除率的比较参考文献[8]的方法进行。

1.3.3  钙果仁活性肽抗氧化试验  小鼠购回后先适应环境4 d，免疫低下模型组小鼠：第1天、第2天、第3天每天每鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg。连续给药3 d，之后随机分为4组，正常小鼠也随机分为4组，分别为空白对照组（每天灌胃0.2 mL/只生理盐水）;钙果仁肽低剂量组、中剂量组和高剂量组（每天灌胃0.2 mL浓度分别为10、20、30 mg/mL的钙果仁活性肽）。连续灌胃14 d，每天自由采食和饮水。

1.4  试样采集与制备

灌胃14 d后，小鼠禁食12 h后摘除眼球取血，肝素抗凝，在0～4 ℃ 3 000 r/min 离心15 min制备血清;颈椎脱臼法处死，取肝脏和肾脏稱重用小剪刀将肝脏和肾脏样品剪碎，在研钵中倒入适量的经过冰浴的生理盐水快速充分研磨，然后用生理盐水配成10%的组织匀浆液，3 000 r/min离心，取匀浆上清液分别测定有关生化指标。

1.5  抗氧化功能指标的测定

组织蛋白质的测定：取肝脏和肾脏匀浆上清液并用生理盐水稀释至适当的浓度，用考马斯亮蓝法[9]测定肝、肾脏蛋白质的浓度。超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性、 丙二醛浓度的测定，按照试剂盒进行测定。

1.6  数据统计与分析

数据采用SPSS软件处理，用单因子方差分析（One-way ANOVN，LSD）进行差异显著性检验，数据以X±s表示。

2  结果与分析

2.1  钙果仁活性肽酶解法的筛选

2.1.1  三酶分步复合水解对DPPH·自由基清除率的影响  如图1所示，由碱性蛋白酶水解30 min后其酶解液对DPPH·自由基的清除率为63.7%，加入胰蛋白酶继续水解30 min后的清除率为82.4%，再加入中性蛋白酶继续水解30 min后的酶解液对DPPH·自由基的清除率可高达93.4%，可知三酶分步复合水解与单酶以及双酶水解钙果仁蛋白相比其对DPPH·自由基的清除率最高，故确定钙果仁蛋白最佳的酶解工艺为三酶复合水解。其酶解工艺为先让碱性蛋白酶在最适条件下水解30 min，灭酶后调pH为8，加入胰蛋白酶在45 ℃下水解30 min灭酶，调pH为7.5，最后加入中性蛋白酶在40 ℃下继续水解30 min后灭酶收集酶解液，经离心、浓缩、冷冻干燥得到欧李仁活性肽。

2.1.2  钙果仁活性肽的制备及其对DPPH·自由基清除率的影响  由图2可知，在1～4 mg/mL浓度范围内，欧李仁活性肽对DPPH·自由基的清除作用随浓度的增加呈上升趋势。当浓度为4 mg/mL时，清除率已达83.3%。当浓度继续升高时，欧李仁多肽对DPPH·自由基的清除率接近100%，当浓度为8 mg/mL时，清除率可达95.5%。多项式回归分析得到回归方程为y=-0.014 2x2+0.193 2x+0.311 1，R2=0.972 2，通过回归方程得出钙果仁活性肽清除DPPH·自由基的IC50为1.06 mg/mL。

2.2  钙果仁活性肽对正常小鼠和模型小鼠内抗氧化活性的影响

2.2.1  钙果仁活性肽对小鼠体重的影响  由表2可知，灌胃钙果仁活性肽14 d后，正常鼠、模型鼠与对照组相比体重都有所增加。正常鼠3个剂量组与空白对照组相比，分别增重了27.4%、44.0%、49.1%，但各组之间差异都不显著（P>0.05），模型鼠3个剂量组与模型对照组相比，分别增重了41.5%、44.2%、60.6%。高、中剂量组显著高于模型对照组（P<0.05），低剂量组与其他组相比差异都不显著（P>0.05）。说明钙果仁活性肽对小鼠的体重增重没有显著增加的作用，但随着钙果仁活性肽剂量的增加，其体重有增加的趋势。

2.2.2  钙果仁活性肽对小鼠体内SOD活性的影响  由表3可知，与对照组相比，不同剂量组小鼠血清中SOD的活力均有所升高，且剂量越大SOD的活力越高。正常鼠与模型鼠低、中、高剂量组血清中SOD的活力均显著高于其对照组（P<0.05），正常鼠3个剂量组之间相比差异不显著（P>0.05），说明对正常小鼠在提高血清中SOD活力方面，钙果仁活性肽低剂量组就可达到较好的效果，而模型鼠在提高血清中SOD活力方面钙果仁活性肽中剂量组就可达到较好的效果。

正常鼠肝脏中低、中、高剂量组与对照组相比都有提高，高剂量组SOD的活性显著高于其他组（P<0.05），模型鼠肝脏中3个剂量组SOD的活性显著高于模型对照组（P<0.05），与对照组相比分别提高了28.5%、29.1%和31.7%，但3个剂量组之间相比差异不显著（P>0.05），说明在提高模型鼠肝脏中SOD的活力方面，低剂量组就可以达到较好的效果。正常鼠与模型鼠肾脏中3个剂量组与对照组相比其SOD的活性都有所提高，且高剂量组SOD的活性均显著高于其他组（P<0.05）。

2.2.3  钙果仁活性肽对小鼠体内GSH-PX活性的影响  由表4可知，正常鼠与模型鼠血清中3个剂量组的GSH-PX的活性均显著高于对照组（P<0.05），且在提高正常鼠和免疫抑制小鼠血清中GSH-PX的活性方面，低剂量组就可达到较好的效果。肝脏中低剂量组与对照组相比差异均不显著（P>0.05），但中剂量组在提高正常鼠和免疫抑制小鼠肝脏中GSH-PX的活性方面，可达到较好的效果。正常鼠肾脏中3个剂量组与空白对照组相比差异不显著（P>0.05），但其GSH-PX的活性均有所上升，说明钙果仁活性肽对提高小鼠血清和肝脏的GSH-PX的活性作用较肾脏中GSH-PX的活性相对较强。模型鼠肾脏中高、中剂量组与低剂量组和模型对照组相比其活力都提高了1倍多，说明高、中剂量组对提高肾脏中GSH-PX的活性有显著作用（P<0.05），但高、中剂量组之间以及低剂量组和模型对照组之间差异都不显著（P>0.05）。