基于量子点甲酚紫FRET比率探针的活细胞硫化氢成像

白敏+曹晓文+陈锋+赵越+赵永席

摘要硫化氢（2S）作为一种重要的气体信号分子，其细胞水平异常与多种疾病的发生发展密切相关。本研究针对现存荧光探针的胞内非特异性响应问題，发展了一种基于量子点甲酚紫的荧光能量共振转移（rster resonance energy transfer，RE）探针，利用比率荧光分析，实现活细胞内2S的灵敏成像。通过一步超声乳化法制备量子点纳米球，再结合叠氮甲酚紫（CVN3）制得无机有机杂化QDSN3比率探针。此纳米探针尺寸均一，粒径约为120 nm，酸性稳定性高，且无细胞毒性。2S可将CVN3上的N3还原成N2，生成的氨基甲酚紫（CVN2）作为RE受体，吸收量子点纳米球的橙色荧光，产生红光信号。通过两个波长的荧光强度的比率分析可有效消除光源强度波动和细胞内复杂环境等的干扰，最终实现了活细胞内2S成像。

关键词量子点； 甲酚紫； 比率荧光； 细胞成像； 硫化氢

1引 言

硫化氢（2S）是继一氧化氮和一氧化碳之后，被发现的第3种气体信号分子[1～]。大量研究证实，其细胞水平异常与多种疾病的发生发展密切相关[5～12]。因此，监测生物体内2S浓度，对于深刻理解生命过程和疾病机制都具有重要的研究意义。目前，研究人员已经开发了多种2S检测方法，如气相色谱法[13]、电化学分析法[1]、比色法[15]和紫外吸收法[16]等。然而这些方法通常需要破坏样本才可检测。相比之下，荧光检测具有时间和空间取样能力及高灵敏度的特性，适用于原位和非侵入性分析[17，18]。迄今为止，已经开发了很多具有优异性能的荧光2S探针，其中大部分优先使用荧光Offon策略，实现敏感检测[19～22]。然而，荧光Offon反应容易受探针浓度、细胞内复杂环境、激发强度等的影响，导致数据失真[23]。相比之下，基于荧光能量共振转移（rster resonance energy transfer，RE）两个波长的荧光强度的比率测量可以有效解决这些问题。

近年出现的量子点新技术开辟了分子成像和荧光分析检测的新领域。量子点是由有限数目的原子组成，其3个维度的尺寸均在纳米数量级，是一种理想的新型荧光探针。相比于有机荧光分子及荧光蛋白等荧光标签，量子点具有以下优点[2～26]：色彩丰富、量子产率高且光化学稳定性好； 激发光谱宽且连续分布，其发射光谱波长范围狭窄且对称、具有很好的单色性且发射颜色易于调控； 能够承受多次的激发和光发射，有持久的稳定性，且光不易被漂白； 尺寸小，空间位阻小，可进行单分子标记； 易于表面功能化修饰，从而可应用于生物体内物质检测。量子点的合成和应用研究在荧光分析检测、活体成像、基因运输、癌症诊断和治疗等方面都得到了很大的发展[27～30]。将量子点与甲酚紫染料结合，制备RE比率探针，用于胞内活性物质的分析检测还未见相关报道。基于此，本研究构建了基于量子点甲酚紫的RE比率探针，此探针合成方法简单、快速，得到的纳米球尺寸均一，粒径约为120 nm，通过M分析证明此探针无细胞毒性，最终实现了活细胞内2S成像。

2实验部分

21仪器与试剂

7700透射电镜（日本日立公司）； Y92Ⅱ超声波细胞粉碎机（中国宁波新芝生物科技股份有限公司）； luoroMax荧光分光光度计（法国oriba obin Yvon公司）； NanoS90激光粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）； 50ELISA酶标仪（瑞士帝肯公司）； iE倒置显微镜（日本尼康公司）。

苯乙烯（≥ 995%）、油酸（分析纯）、甲基丙烯酸（≥ 980%）、nCl2（≥ 980%）、 四水合氯化锰（≥ 990%）、 Na2S（≥ 980%）、 偶氮二异丁腈（≥ 980%）、 NaO（≥ 960%）、 NaNO2（≥ 980%）； 叠氮化钠（分析纯）、 Cl（360%～380%）、 甲醇（≥997%）、 三氯甲烷（≥ 990%），以上试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。甲酚紫（染料含量： ～70%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）； 实验用水为超纯水（美国默克密理博公司，电阻率> 182 MΩ cm）。

22实验方法

221CVN3的制备在0～5℃冰浴条件下， 将NaNO2溶液（10 mmol）加入甲酚紫溶液（10 mmol，溶于2 mol/L Cl）中，均匀搅拌20 min后，缓慢加入NaN3（20 mmol），随后在室温下搅拌2 h，得到棕色沉淀，过滤，乙腈重结晶，干燥，最终得到CVN3棕色固体，保存备用。

222量子点纳米球的制备首先，根据前期工作[31]制备得到油相量子点； 其次，制备两亲性高分子[32]：在50 mL反应釜中加入35 mL三氯甲烷，分别加入006 g甲基丙烯酸、50 g苯乙烯、0096 g偶氮二异丁腈，搅拌混合均匀，100℃反应10 h后冷却至室温。用甲醇洗涤2遍，离心收集固体，70℃干燥3 h，保存备用； 最后，称取50 mg两亲性高分子、15 mg量子点，超声完全溶解于1 mL三氯甲烷，将该油相混合溶液转至10 mL NaO溶液（p=10）中，超声乳化得到乳浊液，水浴加热搅拌，直至三氯甲烷完全挥发，制得量子点纳米球，离心、沉淀再分散于6 mL超纯水，最终浓度为19 mg/mL，保存备用。

223QDSN3比率荧光探针的制备将正电性CVN3溶液（1 mmol/L）与负电性量子点纳米球均匀混合，室温搅拌过夜。10000 r/min离心3次，沉淀再分散，最终得到QDSN3比率荧光探针。

22细胞毒性分析向96孔板每孔中加入1×105 MC7细胞，培养过夜，加入不同浓度QDSN3比例荧光探针，使最终培养基中QDSN3比率荧光探针的浓度为0～200 μg/mL，继续培养2 h， 通过M毒性实验分析不同浓度下细胞的生存情况。细胞存活率随着M甲臜的吸光度（90 nm）的增加而增大。endprint

225基于RE的量子点甲酚紫荧光探针在活细胞内对硫化氢成像分别向8孔板每孔中加入×10 MC7、eLa细胞，培养过夜后，弃去培养液，加入含有QDSN3比率荧光探针（0 μg/mL）的无血清DMEM细胞培养液，饥饿培养3 h后，加入100 μmol/L Na2S溶液，继续培养15 h，用PBS清洗细胞3次，测定细胞成像。

3结果与讨论

31QDSN3比率探针的合成与表征

在芳香重氮盐中，重氮基上的π电子可与苯环上的π电子重叠，共轭作用使其稳定性增加。因此，芳香重氮盐可在冰浴温度下制备和进行反应，可以作为中间体进一步合成叠氮化合物。基于此，本研究在0～5℃下，将氨基甲酚紫（CVN2）上的伯胺与NaNO2作用（在Cl介质下），生成中间产物芳香重氮盐，随后加叠氮化钠，叠氮官能团可以很容易地取代重氮基，得到叠氮甲酚紫（CVN3）（图1A）。通过超声乳化步骤，油相CCl3溶剂中包含有带有合适负电的高分子和发橙光的量子点，将此油相混合物注射入碱性水溶液中，超声，形成水包油（O/W）胶束，通过溶剂挥发组装成量子点纳米球。利用静电反应，将负电性量子点纳米球与正电性CVN3混合，搅拌过夜，离心，得到复合物，命名为QDSN3（图1B）。最后，QDSN3比率探针通过胞吞作用进入细胞质，实现胞内2S成像（图1C）。

通过透射电子显微镜（ransmission electron microscope，EM）及动态光散射（Dynamic light scattering，DLS）对油相量子点的粒径进行测试。通过水热法制备的油相量子点是小且均匀的团簇，平均粒径约为（103±12）nm（图2A和2B），如此小的尺寸使得其包覆更加容易。由图2C可见，合成的QDSN3复合物是球形的，且其表面光滑； 通过DLS的进一步表征（图2D），可看出QDSN3复合物的平均粒径约为120 nm，这样的粒径尺寸不仅可以保证其在血液循环运输过程中的流畅性，且可通过胞吞作用进入细胞，从而发挥作用，实现胞内物质的检测。

本研究制备的量子点纳米球为负电，CVN3为正电，将两者均匀混合，常温孵育过夜，通过静电反应得到QDSN3。对比吸附CVN3前后量子点纳米球的荧光光谱及eta电势（图3），吸附前，量子点纳米球的表面eta电势为Symbolm@@ 56 mV，而吸附CVN3之后的QDSN3復合物，其表面eta电势变为+353 mV，这表明量子点纳米球已成功地通过静电作用结合了大量CVN3，且吸附前后发光位置不发生变化（图3A），通过肉眼即可看到橙色荧光。众所周知，磷脂双分子层构成了细胞膜结构的基本骨架，其中亲水的磷酸基团伸向外面，疏水的脂肪酸在内侧，其中磷酸基团带负电，致使癌细胞表面显负电荷，因此，正电性的QDSN3复合物更易与细胞膜接触，通过胞吞作用进入细胞，从而发生作用。

为考察p值对QDSN3粒径的影响，将QDSN3复合物分散到p 5～100的缓冲溶液中，37℃孵育2 h，通过观察，发现其粒径及荧光光谱都不发生变化，说明其在宽p范围内具有很好的稳定性（图A和B）。同时，为了确保其与细胞膜接触时仍能维持正电性，对QDSN3复合物在DMEM培养基中的性能进行了研究，如图C所示，QDSN3的eta电位依然保持在30 mV左右，维持正电性，因此可实现有效进入细胞。

32QDSN3比率探针与2S作用的机理研究

2S电离生成的S

Symbolm@@ 具有较强的亲核进攻能力，容易将吸电子基团N3还原成强供电子基团N2[1]，使分子荧光光谱发生变化。

为了更加明确QDSN3比率探针检测2S的原理，本研究对其反应机理进行了研究。图5A中，在固定激发波长的前提下（365 nm），激发QDSN3，由于CVN3的吸收波段与量子点的发射波段（绿色实线）没有重叠，且不会被365 nm激发，因此只发射量子点的橙色荧光（591 nm）； 当存在目标物2S时，N3被还原成N2，生成CVN2，其光谱发生红移，此时，CVN2的吸收波段（红色虚线）与量子点的发射波段重叠，发生RE，量子点能量转移给CVN2，探针发射红色荧光（620 nm）（图5B）。

33QDSN3比率探针的响应性能研究

为了验证QDSN3比率探针对检测2S是否具有高选择性，设计了如下实验： 向QDSN3比率探针溶液（330 μg/mL，水乙腈（9∶1，V/V），p=70）中分别加入不同干扰物（100 μmol/L N+，Cys，NOSymbolm@@ 2，COOSymbolm@@ ，S2O2 Symbolm@@ 3； 100 μg/mL BSA，03% 2O2，10 μmol/L GS）溶液及目标物2S（100 μmol/L），室温下反应15 h后，测试其荧光光谱。由图6A可见，只有当目标物2S存在时，QDSN3比率探针才会发生RE效应，发射红色荧光，而其它细胞内活性小分子不会影响QDSN3比率探针的波长及强度。同时，其它金属离子、阴离子及尿素等也不会导致QDSN3比率探针的荧光光谱产生明显变化。综上结果，QDSN3比率探针对检测目标物2S具有高选择性，可用于体外和体内2S的检测。由图6B可见，随着2S浓度增加，量子点的橙色光强度逐渐降低，其能量转移给了CVN2，从而红光强度逐渐升高。通过红光强度与橙光强度的比率可定量分析2S浓度。

Symbolm@@ 3， 100 μg/mL BSA，03% 2O2，10 μmol/L GS）溶液及目标物2S（100 μmol/L）的荧光光谱（λex= 365 nm，反应时间： 15 h）； （B）QDSN3比率探针的荧光光谱与2S浓度的对应关系图。（QDSN3复合物溶液： 330 μg/mL，水乙腈（9∶1， V/V），p=70）

ig6（A） luorescence spectra of 2S （100 μmol/L） and different interferents （100 μmol/L N+， Cys， NSymbolm@@ 2， COSymbolm@@ ， S2O2 3QDSN3比率探针的细胞毒性考察endprint

细胞毒性是体内应用必须关注的问题，其决定了探针在运输过程中的生物安全性。通过M毒性实验对QDSN3比率探针进行了研究，从图7可见，随着探针浓度增加，细胞存活率逐渐降低，细胞毒性略有增大。即使QDSN3比率探针与细胞的孵育浓度高达200 μg/mL，培养2 h后，其细胞存活率依然保持在90%以上。而在胞内2S成像实验中，所使用的QDSN3比率探针的浓度仅为0 μg/mL，此浓度对细胞活性无明显影响。这再次证明本研究制备的QDSN3比率探针适用于细胞内生物活性分子的有效分析。

内源性2S是通过胱硫醚β合成酶和胱硫醚γ裂解酶分别或者协同作用（依据细胞类型），酶解L半胱氨酸及L胱硫醚产生的，人体血浆和多数组织中2S含量约为10～100 μmol/L[6，12，29]。将QDSN3比率探针与MC7（人乳腺癌细胞系）共同培养，探针的运输和摄取过程均可以通过被包覆的量子点的荧光来示踪。如图8所示，空白细胞无背景荧光，当QDSN3比率探针与细胞共孵育培养3 h，通过胞吞作用形成核内体进入细胞，细胞成像图上可看到量子点的强荧光，通过Nikon分析软件将其设定为绿色图像； 而CVN2的光很微弱，将其设定为红色图像。当外加100 μmol/L 2S，继续培养15 h后成像，绿色明显减弱，红色增强，此现象再次证明2S与QDSN3比率探針作用后，产生RE效应。通过NISElements Viewer 20 analysis软件分析，在Merge图像上做纵向剖面线，软件会自动读出此条线上对应的荧光强度数据，再用Origin软件处理得到线状图，分析其上图像强度变化，得到与前面讨论相同的结果。

为了确保QDSN3探针在体内的通用性，选择另一种常见的恶性肿瘤细胞eLa细胞（人宫颈癌细胞系）为模型，将QDSN3比率探针与eLa共同培养，条件同上。 结果（图9）与MC7细胞内2S成像结果类似，空白细胞无背景荧光，当QDSN3探针进入细胞，细胞成像图上可见到量子点的强荧光和CVN2的微弱红光； 当外加100 μmol/L 2S，继续培养15 h后成像，发现量子点的绿色减弱，CVN2红色通道显示强烈荧光，表明RE发生。通过在Merge图像上的纵向剖面强度图可读出，Control组的绿色和红色强度均为0，QDSN3体系的绿色和红色强度分别约为190和2，QDSN3+100 μmol/L 2S体系的绿色和红色的强度分别约为10和220，与细胞成像图结果一致。

结 论

通过一步超声乳化法制备表面含有大量羧基的负电性量子点纳米球，再利用静电反应吸附正电性CVN3制得无机有机杂化QDSN3比率探针。此探针尺寸均一，粒径约为120 nm，可通过胞吞作用进入细胞，在宽p范围的复杂环境下具有很好的稳定性，且无细胞毒性。通过两个波长的荧光强度的比率测量（620 nm /591 nm）可有效消除光源强度波动和细胞内复杂环境等的干扰。最终实现MC7和eLa活细胞内2S成像。此方法为胞内2S及其它活性分子的检测提供了一种新策略。

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Abstractydrogen sulfide （2S） has been confirmed as a significant endogenous gaseous signaling molecule involved in various physiological processes o monitor 2S in living cells， a rster resonance energy transfer （RE） ratiometric probe based on quantum dotcresyl violet was developed In this work， quantum dot nanospheres （QDS） were firstly synthesized via a facile ultrasonication emulsion strategy， and the mixture chloroform solution containing hydrophobic quantum dots and COOfunctionalized amphiphilic polymer were successfully transferred into the oilinwater micelle he negatively charged quantum dot nanospheres with quantum dots embedded in the polymer matrixes were successfully fabricated after the evaporation of chloroform And then， these quantum dot nanospheres were condensed with positively charged cresyl violetazide （CVN3） via electrostatic interaction to obtain the QDSN3 complexes he asprepared QDSN3 complexes were monodispersed nanospheres with an average diameter of about 120 nm hese complexes were taken up by the cell through endocytosis， and they were still stable even in wide p range In addition， the QDSN3 complexes exhibited no cellular toxicity which was verified by M assay In this ratiometric probe， CVN3 as a RE acceptor was conjugated to quantum dot nanospheres he quantum dots emitted at 591 nm and served as the RE donor； once the aryl azide on the CVN3 was reduced to aniline by 2S， the probe emitted at 620 nm he ratiometric probe allowed the elimination of interference of excitation intensity， intracellular environment and other factors urthermore， this method also offered a general protocol for preparing nanosensors for monitoring various small molecular in living cells

KeywordsQuantum dot； Cresyl violet； Ratiometric fluorescence； Cell imaging； ydrogen sulfideendprint