噻呋酰胺人工抗原的合成及酶联免疫吸附分析方法的建立

李潇潇+丁书茂+杨旭+袁均林

摘要以化合物2甲基三氟甲基5噻唑甲酸（MCA）为噻呋酰胺的半抗原合成人工抗原，采用活泼酯法合成免疫原MCABSA，分别采用活泼酯法、混合酸酐法和N，N'羰基二咪唑/二甲氨基吡啶（CDI/DMAP）法合成3种包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3。免疫动物后，最终以包被原MCAOVA3筛选并获得了具有高特异性的噻呋酰胺多克隆抗体，建立了检测噻呋酰胺的间接竞争酶联免疫吸附（icELISA）分析方法。本方法线性检测范围为008～1000 mg/L，半数抑制浓度（IC50）为139 mg/L，检出限为008 mg/L，对自来水、湖水和小麦中的噻呋酰胺添加回收率在720%～1283%之间，检测结果与PLC法具有良好的相关性（R2=0999）。本研究建立的icELISA方法可用于环境水样与小麦等农产品中噻呋酰胺残留的快速检测。

关键词噻呋酰胺； 人工抗原； 多克隆抗体； 酶联免疫吸附分析

1引 言

噻呋酰胺是一种用途广泛的含氟杀菌剂，可有效防治谷物、水果、蔬菜中的多种病害，对纹枯病有特效[1]。噻呋酰胺在水稻和花生中的半衰期分别为91～16 d和91～116 d，而在土壤中的半衰期更长[2，3]。Yang等[]研究发现噻呋酰胺可引起斑马鱼的胚胎发育畸形以及肝脏和肾脏组织损伤。随着噻呋酰胺用量的增加，消费者在日常生活中与之接触的风险也在逐渐升高，使消费者健康受到威胁，因此其残留情况不容忽视。我国国家标准GB 27632016[5]中规定噻呋酰胺在稻谷、糙米和马铃薯中的最大残留量（MRL）分别为7、3和2 mg/kg。

现有的噻呋酰胺残留的检测方法包括高效液相色谱法（PLC）[6]、气相色谱法（GC）[7]、超高效液相色谱串联质谱法（UPLCMS/MS）[8]等，此类方法操作复杂、耗时耗力，而且依赖大型仪器和专业操作人员。建立简单、快速、灵敏和不依赖于大型仪器的方法，对于农药日常监管和残留的快速筛查都具有重要的实际意义，而酶联免疫吸附分析方法（ELISA）可以满足上述要求[9]。

噻呋酰胺的分子结构中无活泼基团，难以直接与载体蛋白偶联制备其抗体。Rejeb等[10]对噻呋酰胺的分子结构进行改造，使用的半抗原包含了噻呋酰胺的整个分子结构，但仅用获得的抗体制备了噻呋酰胺免疫吸附层析柱，并未详述半抗原的制备方法，也未建立起ELISA检测方法。本研究尝试以噻呋酰胺分子结构一半的化合物作为半抗原，通过不同的方法合成噻呋酰胺人工抗原，最终用获得的高特异性抗体建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法（icELISA），可对环境与农产品中的噻呋酰胺残留进行检测。

2实验部分

21仪器与试剂

UV2700紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）； DNM9602型酶标仪（北京普朗新公司）； Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。

噻呋酰胺（98%，上海将来实业有限公司）； 2甲基三氟甲基5噻唑甲酸（MCA，98%，上海书亚医药科技有限公司）； 氯甲酸异丁酯（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体IgG（酶标二抗，武汉亦新生物技术公司）； N， N'羰基二咪唑（CDI，99%）、二甲氨基吡啶（DMAP，99%）、环己基碳二亚胺（DCC，99%）、N羟基琥珀酰亚胺（NS，98%）购于成都西亚试剂公司； 三正丁胺（99%）、牛血清蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）、福氏完全佐剂（CA）、福氏不完全佐剂（ICA）购于Sigma公司； 底物显色液为邻苯二胺（OPD）显色液（OPD mg，02 mol/L Na2PO 257 mL， 01 mol/L 柠檬酸23 mL，d2O 5 mL，30% 2O2 μL，现用现配）； 其它试剂均为国产分析纯或色谱纯。

22实验方法

221人工抗原的合成采用活泼酯法[11]合成免疫原MCABSA； 采用活泼酯法[11]、混合酸酐法[12]、CDI/DMAP法[13]分别合成包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3。所有人工抗原均采用紫外吸收光谱扫描鉴定。

222动物的免疫将只周龄的雌性Balb/c小鼠用MCABSA免疫，免疫方法按文獻[1]进行。

223小鼠血清效价及灵敏度的检测第次免疫结束后第7天，将小鼠断尾取血，收集血清。采用间接ELISA方法检测小鼠血清效价：将3种包被原MCAOVA1、MCAOVA2和MCAOVA3用包被缓冲液稀释到1 μg/mL [15]，包被酶标板，℃包被过夜。用3% 脱脂奶粉封闭，250 μL/孔，37℃孵育1 h，洗板； 加入2倍梯度稀释的系列浓度（从1000～128000倍）的血清，100 μL/孔，37℃孵育1 h，洗板； 加入二抗（100 μL/孔），37℃孵育1 h； 加入底物显色液（100 μL/孔），37℃避光显色15 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L 2SO终止反应，用酶标仪测各孔OD92 nm值，以OD92 nm≈1的血清稀释倍数为效价[16]。

采用间接竞争ELISA方法对血清进行检测：将上述效价检测操作中加血清这一步骤改为加入50 μL 2倍效价浓度的血清和50 μL不同浓度的噻呋酰胺标准溶液，其余各步不变。根据公式（1）计算抑制率（I）：

I （%）=[1-（ODinhitition hole/ODpositive hole）] ×100（1）

将产生目标抗体的小鼠加强免疫后收集血清，选取最适的包被原包被酶标板，建立icELISA检测标准曲线。

22抗体特异性检测选取与噻呋酰胺分子结构类似的含氟农药精吡氟禾草灵、氟铃脲、氟酰胺、三氟羧草醚，采用建立的方法测定，计算IC50值，按照公式（2）计算交叉反应率（CR）：endprint

CR（%）=（IC50（hifluzamide）/IC50（Analyte））×100（2）

225加标回收实验在自来水、武汉东湖水和小麦中添加不同浓度的噻呋酰胺。加标水样直接采用icELISA法或PLC法检测。取10 g小麦粒样品于锥形瓶中，添加噻呋酰胺后，静置过夜。其提取步骤根据文献[17]略有改动：用20 mL丙酮振荡提取并抽滤，重复操作一次，将两次丙酮提取液置于分液漏斗，加入50 mL 5% NaCl溶液，用30 mL二氯甲烷萃取兩次。将两次二氯甲烷相合并，经无水Na2SO脱水，旋转蒸发至近干后，用含20%甲醇的PBS定容至10 mL，待测。以PLC法 [6]测定结果为对照。

3结果与讨论

31噻呋酰胺半抗原的设计

噻呋酰胺的分子结构中不含氨基、羧基、羟基等可与载体蛋白直接偶联的活泼基团。如果在其分子中引入活泼基团，不仅操作复杂、耗时耗力，还要对重塑的半抗原进行质谱鉴定。研究发现，如果获得了某种分子一半结构的物质的抗体，这种抗体对该分子也具有一定的识别能力，也可作为目标物抗体[18～20]。对噻呋酰胺分子而言，含有羧基的MCA是它所特有的一半的结构（图1），因此本研究以MCA作为噻呋酰胺的半抗原与载体蛋白偶联，过程简便，省时有效。

32人工抗原的紫外吸收光谱鉴定

将载体蛋白与人工抗原用PBS调整到1 mg/mL后进行紫外吸收光谱扫描。如图2所示，MCA、BSA和OVA的最大吸收峰分别在26、278和279 nm处，所有人工抗原的吸收曲线与相应的半抗原和载体蛋白相比均发生明显改变，MCABSA、MCAOVA1与各自载体蛋白相比最大吸收峰均发生偏移，MCAOVA2、MCAOVA3与OVA相比在相同的最大吸收峰处吸光度不同，表明所有人工抗原合成成功。

33小鼠血清效价及灵敏度测定

对于含有羧基的半抗原，文献[21～23]均采用活泼酯法合成免疫原，而合成包被原时分别采用了活泼酯法、混合酸酐法和CDI/DMAP法，都成功获得目标抗体。鉴于此，本研究采用活泼酯法合成免疫原，尝试用上述3种方法合成包被原，发现以MCAOVA1为包被原时，虽然检测到所有小鼠血清效价很高，均在1∶6000以上，但将最佳稀释度的血清加入不同浓度的噻呋酰胺标准溶液后，测得各孔抑制率均比较低，表明此包被原所测血清灵敏度低； 以MCAOVA2为包被原时检测到所有小鼠血清效价均低于1∶1000，说明该包被原检测效果不佳； 以MCAOVA3为包被原时，检测到1号、3号和号小鼠的血清效价均低于1∶1000，而2号小鼠的血清效价为1∶2000，并且对噻呋酰胺产生良好的抑制效果。

由此可见，在制备小分子抗体时，即使免疫动物已经产生目标抗体，但须使用合适的方法合成的包被原方可检测出； 此外，动物的个体差异会影响抗体的产生。张存政等[2]在合成双甲胺草磷人工抗原时，免疫原和包被原都采用活泼酯法合成，但在合成过程中加入了少量DMAP，这种改良的方法类似活泼酯法与CDI/DMAP法的结合，可减少杂分子与载体蛋白偶联，有利于目标抗体的产生。

35特异性

抗体对种与噻呋酰胺分子结构类似的含氟农药及半抗原的交叉反应结果如表1所示，与精吡氟禾草灵、氟铃脲、三氟羧草醚和氟酰胺都无交叉反应，表明本研究获得的多克隆抗体对噻呋酰胺具有较高的特异性。

36实际样品检测

自来水、东湖水和小麦样品经PLC检测均不含噻呋酰胺。加标回收实验结果见表2，icELISA法检测噻呋酰胺回收率在720%～1283%之间，RSD<111%。部分加标样品（自来水：1 mg/L， 05 mg/L； 湖水：1 mg/L， 05 mg/L； 小麦：30 mg/kg， 3 mg/kg）经PLC法验证，两种方法的检测结果呈现良好的线性关系（图）， 说明icELISA法具有良好的实用性。 与现有的色谱法相比，ELISA法操作步骤简单，无需使用大型仪器， h内即可完成检测，简便、经济、高效。

结 论

本研究建立了噻呋酰胺人工抗原包被的icELISA检测方法，可实现环境水样与小麦等农产品中噻呋酰胺残留的快速检测，为噻呋酰胺单克隆抗体的制备和建立不同类型的免疫分析方法提供了参考。

Reference

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Yang Y， Qi S， Wang D， Wang K， hu L， Chai ， Wang C azard Mater， 2016， 307： 127-136

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