基于LC-Triple TOF MS/MS技术分析杜仲不同药用部位化学成分差异

严 颖，赵 慧，邹立思，刘训红，柴 川，王胜男，华愉教

(南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)

杜仲(EucommiaulmoidesOilv.)是我国特有的名贵药用植物，其树皮、叶及雄树花均可供药用，分别称为杜仲、杜仲叶及杜仲雄花。杜仲和杜仲叶收载于2015版《中国药典》，具有补肝肾、强筋骨之功效，用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩等症状；杜仲还具有安胎之功效，亦用于妊娠漏血、胎动不安等症状[1]。杜仲雄花具有补肝利胆、通便、安眠等保健功效，且有很高的营养价值，目前已被批准为新食品原料，备受市场关注[2-3]。现代研究表明，杜仲、杜仲叶及杜仲雄花均含有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类等药效成分，具有降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗菌抗病毒、保肝护肾、抗骨质疏松等药理作用[2-5]。虽然三者来源于同一植物，其化学成分类型基本一致，但药效却有所不同。近年来，对杜仲类药材的研究主要集中在化学成分、药理作用和品质评价等方面[6-11]，尚未见杜仲、杜仲叶与杜仲雄花三者化学成分的整体变化或差异性化学成分研究。

液相色谱-质谱联用技术广泛应用于中药复杂体系的定性和定量分析中，常用的质谱技术有四极杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱及复合式串联质谱等[12]。采用高分辨质谱能够测得化合物的精确分子质量，进而获得化合物的分子式，通过多级质谱给出的化合物二级裂解碎片信息，并结合相关文献和数据库资料，可以快速鉴定化合物结构[13]。植物代谢组学即研究不同物种、不同基因类型或不同生态类型的植物在不同生长时期或者受某种刺激干扰前后的所有小分子代谢产物，并对其进行定性、定量分析，找出代谢变化的规律[14-15]。本研究将借鉴植物代谢组学的思路和方法，采用液相色谱-串联三重四极杆飞行时间高分辨质谱法(LC-Triple TOF MS/MS)分析杜仲、杜仲叶与杜仲雄花三者化学成分的差异性，通过多元统计分析找出其中差异显著的化学成分及其变化规律，旨在为揭示杜仲不同药用部位之间药效差异的物质基础提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Triple TOFTM5600 System-MS/MS电喷雾飞行时间高分辨质谱仪：美国AB Sciex公司产品，配有Peakview1.2数据处理工作站；SIL-20A XR超快速液相色谱仪：日本Shimadzu公司产品；Anke TGL-16B离心机：上海安亭科学仪器有限公司产品；BSA224S电子天平：德国赛多利斯公司产品；KQ-500B型超声仪：昆山市超声仪器有限公司产品；Milli-Q超纯水制备仪：美国Millipore公司产品。

松脂醇二葡萄糖苷(批号：111537-200501)、桃叶珊瑚苷(批号：111761-200601)、京尼平苷(批号：110749-200714)、京尼平苷酸(批号：111828-201102)、绿原酸(批号：110753-200413)、咖啡酸(批号：110885-200102)、芦丁(批号：100080-200707)、紫云英苷(批号：11092001)、山奈素(批号：110861-201310)对照品：纯度均大于99%，由中国食品药品检定研究院提供；松脂醇单葡萄糖苷(批号：151205)：成都克洛玛生物科技有限公司产品；隐绿原酸(批号：12112605)、异绿原酸A(批号：12022803)：纯度均大于98%，成都普瑞法科技开发有限公司产品；异槲皮苷(批号：BCBB2943)：纯度≥98%，美国Sigma公司产品；甲醇(批号：143135)：色谱纯，江苏汉邦科技有限公司产品；乙腈、甲酸：均为色谱纯，德国Merck公司产品；实验用水：Milli-Q超纯水。

实验样品：于2016年4月21日采自陕西省略阳县郭镇北河沟(海拔1 455 m，北纬105°42′53″，东经33°23′6″)，每个药用部位采收样品5份(S1～S5为杜仲，S6～S10为杜仲叶，S11～S15为杜仲雄花)。杜仲树皮堆积发汗至内皮变紫褐色后晒干，杜仲叶于50 ℃烘干，杜仲雄花自然晾干。样品经南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定为杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOilv.的干燥树皮、叶和雄花，留样凭证保存于南京中医药大学中药鉴定实验室。

1.2 实验条件

1.2.1色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～10 min(5%～10%B)，10～12 min(10%～15%B)，12～22 min(15%～20%B)，22～35 min(20%～30%B)，35～42 min(30%～60%B)，42～55 min(60%～85%B)，55～57 min(85%～5%B)，57～60 min(5%B)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

1.2.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)负离子模式，质量扫描范围m/z50～1 500，气帘气压力275.8 kPa，雾化气压力379.2 kPa，辅助气压力379.2 kPa，离子源温度550 ℃，喷雾电压-4 500 V，解簇电压-100 V。

1.3 溶液制备

1.3.1对照品溶液 分别取适量的各对照品，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，配制成对照品溶液；分别取0.2 mL各对照品溶液，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇配制成混合对照品溶液。

1.3.2供试品溶液 精密称取0.6 g样品粉末，加入30 mL 50%甲醇，密闭，称定质量后，超声处理(功率250 W，频率30 kHz)20 min，放置冷却，再次称其质量，用50%甲醇补足质量损失，过滤，以12 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.4 样品分析

采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱对分离条件进行优化，以确定最佳的色谱分离条件。根据设定的色谱和质谱条件，取供试品溶液进样分析。

1.5 数据预处理与统计分析

将原始质谱数据和色谱图导入Peakview1.2进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理等，结果保存为文本格式。将文本文件调整后导入SIMCA-P13.0进行分析。采用主成分分析(PCA)法，通过初步观察各样品的聚集情况，直观地表达杜仲不同药用部位的化学组成差异；采用SPSS软件对样品进行聚类分析，观察分组情况；再用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对各样品进行分类，其中R2X、R2Y越接近1，表示模型越稳定，Q2>0.5表示预测率高。根据PLS-DA模型得到的变量权重值(VIP>1)找到潜在的差异化学成分。采用t检验验证多维统计中找到的差异化学成分是否在单维统计中具有显著性差异，其中P<0.05表示有显著性差异。

1.6 差异化学成分的鉴定

根据质谱数据得到主要差异化学成分的质荷比、碎片离子信息等，结合HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)和METLIN(http:∥metlin. scripps.edu/)数据库搜索、标准品比对及文献报道确定或推测化合物的结构信息。

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法的优化

实验分别考察了甲醇、70%甲醇和50%甲醇作为提取溶剂时的提取效果，同时考察了超声提取时间为10、20、40、60 min时对提取效果的影响。为了在最短时间内达到理想提取效率，最终选择用50%甲醇超声提取20 min。

2.2 色谱条件的优化

实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水及乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相时，梯度洗脱条件下样品中各峰分离度的情况。结果发现，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱时，峰型较好且有良好的分离效果。最终确定的最佳色谱条件见1.2.1节。

2.3 样品分析

根据设定的液相色谱-质谱条件，取供试品溶液进样分析。杜仲不同药用部位样品在负离子模式下的LC-Triple TOF MS/MS基峰强度离子流(BPI)色谱图示于图1。

注：a.杜仲；b.杜仲叶；c.杜仲雄花图1 杜仲不同药用部位样品的提取离子流(BPI)色谱图Fig.1 LC-Triple TOF MS/MS base peak intensity (BPI) chromatograms of different medicinal parts of Eucommia ulmoides Oilv.

2.4 多元统计分析

2.4.1PCA及HCA分析 采用PCA法分析杜仲不同药用部位样品的差异性化学成分。结果显示，PCA模型的R2X=0.984，Q2=0.978，表明该模型稳定，预测能力较强。杜仲不同药用部位PCA分析的散点图(t1：0.558；t2：0.427)示于图2，可以看出，杜仲不同药用部位的代谢组可以很明显地分开，各自聚为一类，说明杜仲、杜仲叶和杜仲雄花样品之间的化学成分差异较大。对3组样品的质谱数据进行标准化变换，采用SPSS软件对色谱图进行聚类分析研究。选用欧式距离平方作为样品间的相似性测度，采用最远邻距离的方法进行聚类分析，结果示于图3。可以看出，杜仲、杜仲叶和杜仲雄花样品能够很明显地分为3类，表明三者之间的化学成分差异较大，相对而言，杜仲叶与杜仲雄花样品的化学成分更接近，而杜仲样品与二者的差异更大。

2.4.2PLS-DA分析 用有监督的模式识别方法PLS-DA分析杜仲不同药用部位之间的差异变量，即差异化学成分。变量载荷评价参数值(VIP)用于描述变量的贡献程度，通常以VIP>1的变量作为特征变量。首先对杜仲与杜仲叶样品进行PLS-DA分析，其得分图示于图4a，两个样品沿着PC1轴明显分开。模型验证结果(R2Y=0.968，Q2=0.999)显示，该模型有效可靠。VIP得分图和柱状载荷图分别示于图4b和4c，对两组分类贡献较大的差异性成分(VIP>1)共有121个特征峰。

对杜仲和杜仲雄花样品进行PLS-DA分析，在散点图中，两者可以明显区分，示于图5a。模型验证结果(R2Y=0.982，Q2=0.999)显示其有效可靠。同样，分析两个样品的VIP图(图5b)和柱状载荷图(图5c)，显示共有113个特征峰的VIP值大于1。

对杜仲叶和杜仲雄花样品进行PLS-DA分析，在散点图中两者可以明显区分，示于图6a。模型验证结果(R2Y=0.946，Q2=0.999)证明其可靠程度较高。VIP图(图6b)和柱状载荷图(图6c)显示，对两组分类贡献较大的差异性成分(VIP>1)共有114个特征峰。

2.5 差异化学成分鉴定及相对含量变化

根据质谱数据得到的主要差异化学成分的质荷比、碎片离子信息等，结合HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)和METLIN(http:∥metlin.scripps.edu/)数据库搜索、标准品比对及文献[16-34]检索，对VIP>1且p<0.05的差异化学成分进行结构鉴定，初步鉴定出23个差异化学成分。提取差异成分在各组样品间对应的峰面积代表其相对含量，对杜仲、杜仲叶和杜仲雄花样品中同一物质峰面积的平均值和标准偏差进行计算，得到差异成分在三者间的相对含量变化，结果列于表1。

2.6 结果分析

PCA分析结果显示，杜仲、杜仲叶和杜仲雄花样品在PCA轴上沿PC1轴、PC2轴分开，可以看出杜仲不同药用部位样品分布在不同区域，分类结果较为理想，说明杜仲、杜仲叶和杜仲雄花样品的化学成分存在明显差异。同时观察聚类分析谱系图，在距离为20的位置，杜仲叶和杜仲雄花的样品可以聚在一类，说明二者的化学成分更为接近。通过PLS-DA分析得到23个差异化学成分，它们在3组样品中的相对含量呈现不同的变化规律。其中，杜仲中以桃叶珊瑚苷、去乙酰车叶草苷酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、Eucomoside B、松脂醇单葡萄糖苷的含量较高，均为木脂素类和环烯醚萜类成分；杜仲叶或杜仲雄花中以苯丙素类和黄酮类成分含量较高，其中杜仲叶中以绿原酸、隐绿原酸、芦丁、槲皮素-3-O-丙二酰基-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷、紫云英苷、山奈酚、山奈酚-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷及槲皮素糖苷1的含量较高，杜仲雄花中以愈创木基丙三醇、咖啡酸、烟花苷、异绿原酸A、柚皮素、槲皮素糖苷2及槲皮素糖苷3的含量较高。

图5 杜仲和杜仲雄花样品的PLS-DA得分图(a)、VIP得分图(b)和柱状载荷图(c)Fig.5 PLS-DA scores plot (a), variable importance plot (b) and loading plot (c) of Eucommiae Cortex and Eucommiae Flos Male

图6 杜仲叶和杜仲雄花样品的PLS-DA得分图(a)、VIP得分图(b)和柱状载荷图(c)Fig.6 PLS-DA scores plot (a), variable importance plot (b) and loading plot (c) of Eucommiae Folium and Eucommiae Flos Male

序号No保留时间tR/min化学成分Chemicalconstituent分子式Formula测量值MS1主要二级质谱峰MainpeaksofMS2相对含量变化Relativecontentvariation1∗537桃叶珊瑚苷AucubinC15H22O9391123[M+HCOO]-345，183，165，139A>C>B2554去乙酰车叶草苷酸DeacetylasperulosidicacidC16H22O11389109[M-H]-227，209，183，165，147，121A>C>B3653愈创木基丙三醇GuaiacylglycerolC10H14O5213078[M-H]-165，121，97，93，89C>A>B4∗847京尼平苷酸GeniposidicacidC16H22O10373113[M-H]-747232[2M-H]-211，193，167，149，121A>C>B51407槲皮素糖苷1Quercetinglycoside1C32H38O21757184[M-H]-803186[M+HCOO]-595，463，301B>C>A6∗1496绿原酸ChlorogenicacidC16H18O9353087[M-H]-191，179，135B>C>A7∗1541隐绿原酸CryptochlorogenicacidC16H18O9353088[M-H]-191，179，135B>C>A8∗1582京尼平苷GeniposideC17H24O10433134[M+HCOO]-225，207，123A>C>B9∗1675咖啡酸CaffeicacidC9H8O4179036[M-H]-135C>B>A10∗1801松脂醇二葡萄糖苷Pinoresinol⁃di⁃O⁃β⁃D⁃glucopyranosideC32H42O16681234[M-H]-519，357，151A>B=C111907槲皮素糖苷2Quercetinglycoside2C27H30O17625138[M-H]-463，301，271，255，179C>B>A

续表1

注：标*的化合物已与对照品比对确定；A表示杜仲，B表示杜仲叶，C表示杜仲雄花

3 讨论

现代研究表明，在杜仲中相对含量较高的木脂素类化合物具有降压、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、保肝及抑制血小板活化因子等生理功能，是杜仲护肾的活性成分之一；环烯醚萜类化合物也以杜仲中含量较高，具有抗菌、抗炎、止痛、利胆、保肝、通便、降压、镇静、抗肿瘤等生理功能，其中桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸为保肝、降血脂、降压的活性成分；苯丙素类和黄酮类化合物以杜仲叶和杜仲雄花中含量较高，苯丙素类化合物具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、保肝护肝等生理功能，其中绿原酸是抗菌、抗病毒、抗氧化、降压的活性成分，咖啡酸有降压、抗氧化等生理活性；黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗骨质疏松等生理功能[4-5,32,35-37]。活性成分含量的差异可能表现为临床药效的差异。以降压作用为例，杜仲叶在急性动物实验中，剂量为杜仲的2倍时，才呈现与杜仲相近的降压效果。这是因为主要降压成分木脂素类和环烯醚萜类[35]在杜仲中含量较多。此外，杜仲雄花水提液抑菌、抗炎、镇痛作用强于杜仲和杜仲叶[38]，这可能与其黄酮含量较高有关。从本实验初步研究结果可见，杜仲、杜仲叶、杜仲雄花三者化学成分存在明显差异，其临床功效亦存在差异，有必要开展进一步研究并建立关联。

4 小结

本实验建立了基于LC-Triple TOF MS/MS结合多元统计分析技术分析杜仲不同药用部位中化学成分差异的方法，并对分析结果进行探讨。比较杜仲、杜仲叶和杜仲雄花中化学成分相对含量差异，仅仅是对三者临床药效差异的初步探讨，由于杜仲、杜仲叶和杜仲雄花中整体化学成分的潜在差异，可能会导致其在体内的吸收、代谢及效用有所不同，最终导致三者临床使用不同。

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