高光谱图像检测马铃薯植株叶绿素含量垂直分布

孙 红 ，郑 涛 ，刘 宁 ，程 萌 ，李民赞 ※，Zhang Qin

（1. 中国农业大学“现代精细农业系统集成研究”教育部重点实验室，北京 100083；2. 美国华盛顿州立大学精细农业及农业自动化研究中心，WA，99350.）

0 引 言

植物叶片中的叶绿素在光合作用过程中起着重要作用，叶绿素浓度与氮素含量紧密相关，是评价植物生长状况的一项重要指标[1-3]。基于叶绿素对特定波长光谱的吸收和反射等特性[4-5]，国内外已经开展了叶绿素和氮素的光谱学诊断和相应的传感器开发研究[6-8]。

对水稻、玉米等禾本科作物，在敏感参数筛选、不同叶位光谱差异、生长动态响应、诊断建模方法等方面进行了深入研究[9-10]，证明了由于叶绿素的转移性导致植物不同叶龄叶位间存在垂直分布差异的特点，形成植物叶片光谱对叶绿素诊断的空间差异性[11-12]。Yuan等[13]使用彩色扫描仪绘制成熟稻叶中叶绿素的动态分布，以方差分析结果作为判定依据，表明第四片完全展开叶上2/3位置点位上的SPAD（soil plant analysis development）值能最好的预测成熟水稻植株的氮素含量，相关系数最高为 0.96。杨绍源等[14]选用不同观测角度组合的光谱植被指数，建立不同高度层的冬小麦叶片氮含量诊断模型，结果表明改进后的绿光归一化指数反演上中下三层氮密度决定系数分别达到 0.722，0.7124，0.6884。王磊等[15]对单因素氮处理下春玉米不同层位叶片光谱反射率与氮含量作了相关分析，结果表明第 6片完全展开叶叶片光谱反射率与氮含量在可见光波段存在较高的负相关关系，最高可达0.97，并选取550和720 nm两波段组合的光谱参量 ( LgR（ 55 0 ） + L gR（ 72 0）和 L g( R( 5 50) +R(7 20)))建立了线性诊断模型。

马铃薯是中国第四大主粮，属茄科作物，与小麦、水稻等禾本科大田作物相比，在营养吸收、分配和转移等方面，不是自下向上式由根部供给上部叶片和籽粒，而是受块茎生长影响，在生长前期地下养分向上供应促进茎叶生长为马铃薯块茎形成做准备，而中后期（开花期后）主要转入供给地下茎促进果实膨大。因而，现有小麦、水稻等作物叶绿素光谱学诊断的成果无法在马铃薯作物中进行简单套用。

针对马铃薯作物现有研究主要集中于马铃薯不同生长期冠层光谱动态分析。国外，Jongschaap等[16]分别对马铃薯叶片、植株和冠层3个尺度光谱数据研究结果发现，叶片尺度 SPAD值与氮素含量呈指数相关（R=0.91），叶片 SPAD 值可代表约 0.44 m2面积上冠层光谱诊断的结果，反映了叶片光谱与氮素分布之间的尺度关系。Maji等[17]通过对比不同施氮水平，发现生长早期随施氮量的增加，马铃薯叶片光谱反射率呈下降趋势，生长到 60 d后，无论施氮量如何变化，反射率始终恒定在0.05～0.06之间，认为光谱学适用于马铃薯植株生长前期诊断。

国内于静等[18]采用基于656和774 nm波长的主动作物冠层传感器GreenSeeker对马铃薯各生育时期进行实时监测，表明苗期至封垄前归一化植被指数（normalized difference vegetation index，NDVI）值与植株吸氮量呈显著的指数关系（R2=0.665），封垄后NDVI值与地上部植株氮浓度呈显著的线性关系（R2=0.699）。Sun等[19]利用绿、红和近红外波段的冠层图像反射特征，构建了比值植被指数（ratio vegetation index，RVI）、归一化植被指数（NDVI）、土壤调整型植被指数(soil adjusted vegetation index，SAVI)等6个植被指数，分析建立了块茎形成期冠层氮素含量诊断模型。

目前，针对马铃薯植株体叶片叶绿素垂直分布差异与生长期动态特性，未见报道。因此，为了探明马铃薯植株在生长过程中叶绿素垂直动态响应，本研究采用高光谱成像技术，首先针对植株体垂直分布的不同叶位叶绿素含量诊断和空间分布绘制展开方法研究。讨论筛选了马铃薯叶片叶绿素诊断敏感波长，建立了叶绿素含量诊断模型，基于马铃薯叶片叶绿素分布可视化分析，形成了马铃薯植株不同叶位的叶片叶绿素含量空间分布图，为探明马铃薯植株生长期叶绿素动态响应奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本处理

试验对象为大西洋品种马铃薯，地点位于中国农业大学水利与工程学院温室。马铃薯于2017年4月份种植，生长过程中不作任何特殊处理，保证每颗植株生长条件基本一致。对象生长期为开花期，依据叶片生长序列将马铃薯叶片进行降序排列，如图1所示，其中12～9片为上叶，8～5片为中叶，4～1片为下叶。人为对马铃薯植株叶片进行拔除处理，在不同马铃薯植株的 3个叶位上随机各采集22个叶片，总计66个叶片样本，装入密封袋，以保持叶片新鲜，带回实验室马上对马铃薯叶片进行高光谱图像信息采集。

图1 马铃薯植株3个叶位Fig.1 Three leaf positions of potato plants

为分析叶片上叶绿素分布情况，对叶片进行采集区域划分，并利用手持式SPAD-502叶绿素仪进行叶绿素含量指标无损检测[20-22]。其中，SPAD叶绿素计通过650和940 nm处的透射光谱相对比值来计算叶绿素含量参数，是常用的叶绿素含量参考指标[23-24]。

依据 SPAD探头传感器覆盖面完整且尽可能等距间隔为原则，对样本叶片划分4～8个区为光谱采集区域。为了减少实验误差，在同一区域上测量3次SPAD值，取其平均值作为该区域的叶绿素指标值，最终通过对 66个马铃薯叶片样本的测量，获得了 400个区域的 SPAD值，其中上叶部分取 140个，中叶和下叶部分各取 130个。测得SPAD值的区域编号标记，以便提取相应的光谱。

1.2 马铃薯叶片高光谱图像信息获取

本文所采用高光谱成像系统是 Gaia高光谱成像系统，其原理图如图2所示，主要由镜头（OL23）、面阵CCD侦测器（LT365）、光谱仪（V10E）、均匀光源（2套溴钨灯）、电控移动平台、计算机及控制软件等部件组成。

在试验开始前，须先预热系统以消除基线漂移的影响。然后对高光谱成像仪进行调焦，设置系统曝光时间为15 ms，移动平台移动速度为2.8 mm/s。采集时将马铃薯叶片平放在移动平台上，开始使用 SpecVIEW 软件采集高光谱图像数据。摄像头分辨率为1 394×1 024，光谱分辨率为2.8 nm，采样间隔为0.65 nm，光谱范围为382～1 019 nm，则采样光谱波长范围内包含1 440个波长变量，最终得到一个包含了影像和光谱信息的三维数据立方体。

图2 高光谱成像系统原理图Fig.2 Schematic diagram of hyperspectral imaging system

1.3 高光谱图像黑白校正

为消除光照不均匀和外界环境因素的影响，在数据处理前对高光谱图像进行黑白校正[25-26]。在和采集时相同条件下，盖上镜头盖且关闭光源进行全黑校正，取下镜头盖打开光源进行白板校正，然后对原始图像按照式（1）进行校正。

式中 I为黑白校正后图像数据，W为全白标定图像数据（反射率接近99%），B为全黑标定图像数据（反射率接近0），I0为原始图像数据。

1.4 数据处理

对马铃薯叶片高光谱图像进行处理主要包括光谱数据分析和图像数据处理 2部分。其中，光谱数据预处理采用标准正态变量校正方法，光谱数据处理主要包括马铃薯叶片叶绿素含量敏感波长的筛选与叶绿素含量诊断检测，研究分别采用了相关系数（correlation coefficient，CC）分析法和随机蛙跳（random frog，RF）算法进行波长筛选。对叶片对象各像素点的叶绿素含量分布图利用伪彩色处理实现。

1.4.1 标准正态变量校正方法

标准正态变量（standard normal variate，SNV）校正方法是假设每个波段的光谱值满足某种标准的数据分布，如正态分布等，然后假设的数据分布信息对已知的光谱进行修正补偿[27-28]。SNV方法常用于消除粒子散射对光谱数据产生的影响。SNV变换公式为

式中x为预处理后光谱数据， xi为原始光谱数据，为光谱数据平均值，δ为光谱数据标准差。

1.4.2 随机蛙跳算法

随机蛙跳（RF）算法是一种变量选择方法，该方法是一种类似于可逆跳转马尔科夫链蒙特卡洛（reversible jump Markov chain Monte Carlo，RJMCMC）算法，通过在模型空间中模拟一条服从稳态分布的马尔科夫链，来计算每个变量的被选概率，从而用于评价变量的重要性[29-30]。

随机蛙跳算法主要的运算步骤包括以下3步：1）初始化时，一个变量子集V0包含Q个变量；2）基于原始变量子集，选出候选变量子集V*，包含Q*个变量；选择V*作为V1来代替V0，直到N次迭代终止这一过程；3）计算每个变量的被选择概率，以此作为选择变量的标准，越高越好。

1.4.3 建模方法

偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）是基于成分提取思想，可解决变量之间多重相关性的问题。PLSR对光谱反射值矩阵和叶绿素含量矩阵同时进行分解，并在分解时考虑两者之间相互关系，加强对应计算关系，从而保证获得最佳的校正模型。建立了定量分析模型后，采用预测值与实测值的决定系数R2进行模型的评估。决定系数越接近1，则模型预测精度越高。

数据分析处理工作利用ENVI 5.1软件进行光谱数据读取，后续处理采用EXCEL2016和Matlab R2014a软件完成。

2 结果与分析

2.1 马铃薯叶片光谱曲线分析

用ENVI 5.1选取SPAD值测量位置的10×10矩形区域为感兴趣区域（region of interesting，ROI），然后分别提取每个样本ROI的平均光谱，1片马铃薯叶片样本的6个感兴趣区域分布如图3所示，其中L1、L2、L3分别代表叶脉左侧底部、中部、顶部 3个位置的感兴趣区域，R1、R2、R3分别代表叶脉右侧底部、中部、顶部3个位置的感兴趣区域。每个区域的原始平均光谱曲线及其在波段在500～600 nm处的放大图分别如图4a和图4b所示。

由于在封闭灯箱中采集马铃薯叶片高光谱图像，避免了外界光照环境因素的影响，总体而言，如图4a中6个感兴趣区域的平均光谱曲线波形较为接近。由于叶绿素的强反射作用，光谱曲线550 nm附近出现了波峰；由于叶绿素的强吸收作用，光谱曲线650～700 nm波段附近出现了波谷；在700～750 nm波段处光谱反射率急剧上升，750～1 019 nm马铃薯叶片光谱呈波状起伏的高反射率特性。同一叶片上不同位点的光谱曲线在 500～600 nm波段上存在差异，如图4b所示，总体趋势为叶脉左侧光谱反射率高于右侧，同一侧叶片不同位点光谱反射率从底端向顶端呈升高趋势，即L1＜L2＜L3，R1＜R2＜R3，这与叶片养分由底部叶柄向叶边缘输送导致的色素体吸收关系一致。

图3 马铃薯叶片感兴趣区域Fig.3 Regions of interesting in potato leaves

图4 原始平均光谱曲线及其放大图Fig.4 Original average spectral curves and its enlarged view

分析上、中、下 3个叶位叶片的高光谱图像数据形成的三维数据立方体如图5a所示，立方体x-y-z坐标系中，z轴表示对应光谱波长其范围为382～1 019 nm，在每个波长下x-y轴平面形成一幅二维图像，从而构成高光谱立方体数据。上、中、下 3个叶位叶片的平均光谱曲线如图5b所示，总体上部和中部叶片反射率曲线较为接近，而下部叶片反射率曲线与它们的差异较大，是由于马铃薯作物茎叶自下而上生长所致，下部叶片先长叶龄较老，而上部和中部后长叶龄较为接近。其中，光谱反射率在382～700 nm区间随叶位的升高反射率增加（上＞中＞下），在700～1 019 nm范围，下叶位反射率高于上部和中部叶位（下＞上＞中）。

分析其原因，382～700 nm范围内由于在382～490和600～700 nm范围叶绿素和类胡萝卜素等色素体呈强吸收作用，490～600nm为叶绿素强反射作用区，因此下部老叶叶绿素等色素体作用大于顶部新叶，从而反射率呈自下而上分布状态。在700～1 019 nm范围主要反映植物活力和预防过度增热的适应性，由于马铃薯开花期是叶片生长的转折期，此后底部老叶会逐步转黄和枯落，因此其吸收低于顶部新叶，呈现出反射率高于上部叶片。同时也可以发现马铃薯叶片各叶位叶片在840、895和955 nm附近有微弱水分吸收谷存在。综上所述，马铃薯植株不同叶位的平均光谱曲线在382～700和700～1 019 nm内分别呈垂直分布特性，开花期下部叶位生长响应变化最为明显。

图5 不同叶位叶片的三维数据立方体和平均光谱反射率Fig.5 Dimensional data cube and average spectral reflectance of different leaf positions

2.2 马铃薯叶片SPAD值统计

针对采集的400个样本，SPAD值范围为29.1～55.7，平均值为42.31，其中SPAD值主要集中在35.6～52.1区间，占总样本数的78.25%。研究采用Kennard-Stone算法对样本进行筛选以划分校正集和预测集，300个样本为校正集，100个为预测集。不同叶位的样本SPAD值分布如表1所示，自下而上不同叶位的SPAD均值依次为36.41、43.11、47.04。这与SPAD值的计算相关，SPAD值的计算公式如式（3）所示。

式中K为常数；IRt为接收到的经过叶片的940 nm红外光强度，IR0为发射的红外光强度；Rt为接收到的经过叶片的650 nm红光强度，R0为发射的红光强度。由于，光谱反射率在382～700 nm区间随叶位的升高反射率增加,在700～1 019 nm范围下叶位反射率高于上部和中部叶位，因而自下而上不同叶位的 SPAD最大值、最小值和均值均依次增大。

表1 样本SPAD值基本统计Table 1 Basic statistics of SPAD of samples

经过划分数据集的样本SPAD值，校正集SPAD值范围与样本总体一致（29.1～55.7），验证集数据范围包含于校正集中（30.2～54.4）。

2.3 特征波长筛选

为减少叶片结构背景噪声、样本表面纹理等因素的影响，在模型建立前对采集的马铃薯叶片高光谱图像原始光谱采用标准正态变量校正（SNV）进行预处理。经过SNV预处理后的所有原始平均光谱曲线如图6所示。处理后，研究分别采用相关系数分析法和随机蛙跳算法对马铃薯叶片叶绿素特征波长进行筛选。

图6 SNV预处理后的所有平均光谱曲线Fig.6 All spectral curves of SNV pretreatment

2.3.1 相关系数分析法筛选

对马铃薯叶片 SPAD值与其对应区域的平均光谱反射率进行相关性分析，处理结果如图 7所示。图中显示了不同波长下的相关系数大小，以相关系数的绝对值大小降序排序，筛选出相关系数绝对值高于0.64的12个波长变量作为特征波长变量，分别为533.84、534.27、536.86、537.30、540.32、544.22、547.25、547.69、548.12、550.29、706.9、708.23 nm。

2.3.2 随机蛙跳算法筛选

采用Matlab R2014a软件分析，设置随机蛙跳（RF）算法运行次数N为10 000次，主成分个数A为10，蛙跳初始模型中的变量数Q为 2，运行后以每个变量指数所对应的选择可能性为筛选依据，将选择可能性大小按降序排列。采样光谱波长范围内包含1 440个波长变量，每个波长变量依次对应一个变量地址，取选择可能性大于0.46的变量地址对应的波长变量，将其作为特征波长变量。最终通过RF算法筛选出特征波长变量个数为11个，分别为554.62、560.26、575.04、576.35、595.09、604.7、649.44、731.8、752.78、786.38、789.97 nm。RF 算法运行结果如图8所示。

图7 相关系数分析法结果Fig.7 Results of correlation coefficient analysis

图8 随机蛙跳算法运行结果Fig.8 Results using Random Frog

2.4 PLSR回归模型建立

分别采用相关系数分析法（CC）和随机蛙跳算法（RF）筛选得出的特征波长变量，建立马铃薯叶片叶绿素PLSR光谱诊断模型。

将特征波长变量对应的光谱数据分别作为X变量，将马铃薯叶片样本SPAD值作为Y变量，建立 CC-PLS模型和RF-PLS定量分析模型。

为减小光谱冗余信息对于模型精度的影响，2种模型均采用 10倍交叉验证的算法，得到交叉验证均方差RMSECV随主成分个数增加的变化趋势，如图9所示。

图9 随着主成分个数增加RMSECV变化趋势Fig.9 Tendency of RMSECV with increasing of principal components

由图 9可知，CC-PLS模型在主成分个数为 1时，RMSECV值最小，最小值为3.036 6，而RF-PLS模型在主成分个数为4时，RMSECV值最小，最小值为2.522 9，由此建立CC-PLS模型和RF-PLS模型。然后将验证集中的光谱数据作为X变量代入2种模型，分别得出马铃薯叶片叶绿素预测情况如图10所示。CC-PLS模型的建模精度RC2为0.758 8，验证精度RV2为0.577 3，而RF-PLS模型的建模精度RC2为0.842 3，验证精度RV2为0.767 6。

比较CC-PLS和RF-PLS模型可知，基于相关系数法（CC）选取的马铃薯叶绿素指标的 12个波长主要位于530～550 nm（10个）和706～708 nm（2个），而RF法选取的11个波长范围主要位于550～650 nm（7个）和730～786 nm（4个）。相比之下，相关系数法选取的波长范围比较集中且相邻间隔小，主要表征了绿色反射峰处的光谱特性，其波长之间存在显著线性相关，相关系数最高为0.9 944；而RF法选取波长范围较广且波长之间相距较远对整体马铃薯叶片光谱范围代表性较高，即由于CC法选取波长多重共线性导致模型精度低于RF选取的波长所建立模型。

图10 马铃薯叶片叶绿素预测Fig.10 Prediction of chlorophyll in potato leaves

综上，择优选取RF-PLS模型用来绘制不同叶位马铃薯叶片叶绿素分布图。RF-PLS模型为：

式中Y表示叶片SPAD值，X为特定波长处经过SNV预处理的光谱反射率。

2.5 马铃薯叶片叶绿素分布图

利用 RF-PLS模型可以估算马铃薯叶片每个像素点的 SPAD值，然后结合伪彩色处理技术可以绘制马铃薯叶片叶绿素分布图，图中 SPAD值范围为 0～60，每个SPAD值依次对应一种颜色表中的颜色。具体步骤如下：

1）获取马铃薯叶片高光谱图像在RF算法筛选出的11个特征波长下的图像；

2）提取特征波长图像中各像素点的反射率值；

3）代入模型计算每个像素点的SPAD值，得到一幅灰度分布图；

4）对灰度分布图进行伪彩色处理，绘制不同叶位马铃薯叶片叶绿素分布图，结果如图11所示。

图11中，不同颜色（黄、绿、蓝）和颜色深浅程度代表不同浓度马铃薯叶片叶绿素含量。总体叶片叶绿素含量由底部叶柄向顶部叶边缘逐步降低，由中心叶脉向两侧叶边缘降低；不同叶位间直观看出叶绿素含量分布：上＞中＞下，这与马铃薯叶片SPAD值实际测量时的分布和变化趋势一致。在上叶中，整体绘制颜色分布均匀且黄色和绿色较深，可能是由于上叶还在生长旺盛期，所含叶肉较多，叶绿素表征的叶片功能生长旺盛。相比之下，中叶和下叶叶绿素伪彩色普遍为绿色和蓝色，且绿色部分主要集中在叶脉处，这是由于随着下部叶片的逐渐老化，叶边缘叶绿素含量减少随后会呈现枯萎卷曲等生理变化，营养主要表征在叶脉间传输。上述结果与栽培学家探明的马铃薯开花期后，转入地下茎膨大生长时，下部功能叶片逐渐枯黄脱落的现象阐述一致。在由此可知，基于高光谱成像技术的RF-PLS模型可用于马铃薯植株叶绿素垂直分布可视化，预测不同叶位马铃薯叶片叶绿素分布及其生长响应。

图11 三个叶位马铃薯叶片叶绿素分布Fig.11 Chlorophyll distribution of potato leaves in three positions

3 结 论

为分析马铃薯植株体叶片叶绿素垂直分布差异与生长期动态特性，研究采集了不同叶位的马铃薯叶片高光谱数据，提取了马铃薯叶片 SPAD值测量位置的平均光谱，采用标准正态变量校正（SNV）方法进行光谱预处理，建立了基于特征波长变量的马铃薯叶片叶绿素偏最小二乘（PLS）诊断模型，绘制了不同叶位马铃薯叶片叶绿素分布图，主要研究结论如下：

1）分析了植株垂直叶位间光谱和叶绿素分布关系，结果表明马铃薯开花期茎叶自下而上，其光谱反射率在382～700 nm区间随叶位的升高反射率增加（上＞中＞下），在700～1 019 nm范围，下叶位反射率高于上部和中部叶位（下＞上＞中)，且自下而上不同叶位的SPAD均值依次为 36.41、43.11、47.04。

2）利用相关系数分析法和随机蛙跳算法分别筛选了特征波长，建立叶绿素诊断CC-PLS和RF-PLS模型，RC2分别为0.7 588和0.8 423，验证精度RV2分别为0.5 773和0.7 676。

3）选取利用RF-PLS模型计算马铃薯叶片每个像素点的叶绿素含量，进而绘制不同叶位马铃薯叶片叶绿素分布图，可反映马铃薯在开花期植株上叶片叶绿素动态响应关系，最终实现了不同叶位马铃薯叶片含量无损检测以及叶绿素分布可视化表达。

本研究是对马铃薯植株垂直方向上不同叶位叶绿素含量诊断与分布可视化分析的初步方法研究，未来针对不同生长期动态还需要在大田进行试验验证，以期为开展马铃薯冠层整体动态诊断奠定基础。

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