副猪嗜血杆菌临床分离菌的药物敏感性试验与ERIC-PCR基因分型

孙华润,翟亚军,蔡 田,徐引弟,苑 丽,潘玉善,刘建华,吴 华,胡功政*

(1.河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州 450002;2.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所,河南 郑州 450002)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌,具有条件致病性,是猪Glasser病的病原菌,可引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等[1],是目前影响养猪业最严重的细菌病之一。猪副嗜血杆菌在环境中普遍存在,只感染猪,可以影响从2周龄到4月龄的青年猪,猪主要在断奶前后和保育阶段发病,通常见于5～8周龄的猪,发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%。除了细菌直接感染外,猪群还常会由猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒、猪流感以及猪呼吸道冠状病毒等继发感染[2]。

通过使用疫苗可以控制副猪嗜血杆菌病,但是已有报道表明血清型多样性和大量无法分型的菌株对交叉保护性疫苗的研制存在负面影响[3]。目前副猪嗜血杆菌病的防治主要依靠抗菌药物,但由于抗菌药长期盲目的使用,HPS对临床常用抗菌药已产生不同程度的耐药性,耐药菌株的流行给该病的治疗带来了极大挑战,所以临床上对其药物敏感性进行长期监控已成为防治的关键[4]。作者于2015年10月～2017年5月从河南、湖北、山西等7个省分离鉴定了HPS 104株,观察了这些分离菌株对12种抗菌药物的耐药表型,并采用ERIC-PCR方法对104株临床分离株进行了基因分型分析,旨在为副猪嗜血杆菌病的防治及抗菌药物的合理使用提供理论依据,为分析耐药菌的流行特点,进一步研究耐药性、耐药基因的传播扩散机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 从河南农业大学动物医院、河南省农业科学院畜牧所、信阳农林学院动物医院、华中农业大学动科动医学院,以及江西、湖南、陕西、安徽、山西等代表性猪场送检的疑似副猪嗜血杆菌典型病变的肺脏、脾脏、淋巴结等部位采集样品323份。

1.1.2 主要试剂 新生小牛血清购自杭州四季青有限公司;烟酰胺嘌呤二核苷酸(NAD)购自Roche公司；2×PCR Taq Master Mix、ddH2O、DSTM2000 DNA Marker均购自康为世纪(北京)生物科技有限公司。

1.1.3 培养基 巧克力平板(CAP)、胰蛋白大豆琼脂培养基(TSA)和胰蛋白大豆肉汤培养基(TSB)均购自北京陆桥技术有限责任公司。

将高压灭菌的TSA在室温下冷却至不烫手时,每100 mL加入0.01 g/mL NAD(经0.22 μm滤器过滤)1 mL及新生小牛血清5 mL[5],混合均匀后倾倒平板备用。同样对高压灭菌的TSB,每100 mL加入0.01 g/mL NAD(经0.22 μm滤器过滤)1 mL及新生小牛血清5 mL。

1.1.4 药物 盐酸四环素TET(含量85%，批号150608)由阜南诺伟康生物科技有限公司生产;环丙沙星CIP(含量85%，批号150418)、氨苄西林AMP(含量90%,批号091008)、复方磺胺-5-甲氧嘧啶钠SMD-TMP(质量比5∶1,批号160720)均由河南大明兽药有限公司生产;林可霉素LN(含量82.5%，批号160326)由扬州联博药业有限公司生产;头孢噻呋钠CTX(含量95%，批号151108)由山东莱芜泰康药业有限公司生产;头孢喹肟钠CTC(含量95%,批号151014)由河北远征药业有限公司生产;卡那霉素KM(含量98%，批号160622)、甲砜霉素THI(含量98%，批号160723)均由广东粤农兽药集团有限公司生产;痢菌净MEQ(含量98%，批号150601)由山西省芮城县第二兽药厂生产;酒石酸(单氢)沃尼妙林VAL(含量98.7%，批号150721)由北京康农兴牧科技发展中心生产;红霉素ERY(含量98%，批号150812)由广州辛利达兽药有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化 在无菌条件下分别自肺脏、脾脏、淋巴结等病料中取样,划线接种于巧克力平板,37 ℃培养20～24 h。观察细菌的菌落形态,挑取疑似菌落接于TSB(加0.1‰ NAD和5%血清)中。 经多次划线纯化培养,保存。从同一头病死猪不同部位样品分离的细菌计为同一个菌株。

1.2.2 细菌鉴定 取菌液10 μL于干净的载玻片上,自然晾干后进行革兰氏染色,在油镜下观察,并记录细菌的菌体形态。另取菌液在TSA平板上划线,并在平板上垂直接种金黄色葡萄球菌,37 ℃恒温培养20～24 h。使用分离菌的菌液作为PCR扩增模板,利用Oliveira S等报道的上、下游引物(HPS F:5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′;HPS R:5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′)进行16s RNA的鉴定[1],预期扩增片段在831 bp左右。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系(25 μL)包括：2×PCR Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 7.5 μL,F 1 μL,R 1 μL,模板3 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性10 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,37个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.2.3 药敏试验 采用微量肉汤稀释法(CLSI,2013;CLSI,2016)[6-7],分别对河南、湖北、湖南、山西、陕西、安徽和江西等7个省份的临床分离株进行MIC测定,分析MIC分布,计算MIC50和MIC90,并对7个省的菌株对各类抗生素的耐药率进行SPSS显著性差异分析。选用的12种抗菌药物包括:四环素TET(MIC≥2为耐药)、环丙沙星CIP(MIC≥2为耐药)、林可霉素LN(MIC≥2为耐药)、氨苄西林AMP(MIC≥4为耐药)、头孢噻呋CTX(MIC≥2为耐药)、头孢喹肟CFPM(MIC≥2为耐药)、卡那霉素KM(MIC≥64为耐药)、痢菌净MEQ(MIC≥32为耐药)[7]、沃尼妙林VAL(MIC≥64为耐药)[7]、甲砜霉素THI(MIC≥8为耐药)、红霉素ERY(MIC≥16为耐药)[8]、复方磺胺-5-甲氧钠SMD-TMP(MIC≥4为耐药)[9]。美国临床和实验室标准系会(CLSI)中尚无副猪嗜血杆菌药物敏感性测定的标准方法。胸膜肺炎放线杆菌(App)与副猪嗜血杆菌的亲缘性较近且均为猪呼吸道病的病原菌,所以本实验的质控菌株采用胸膜肺炎放线杆菌(App)ATCC27090,购自中国普通微生物菌种保存中心。

1.2.4 基因组的提取 菌液用肉汤培养16～20 h,抽取1.5 mL菌液于离心管中,以12000 r/min离心8～10 min,弃去上清液,收集菌体(再次收集1.5 mL菌液,离心,弃去上清液,再次收集沉淀菌体),加入200 μL TE缓冲液悬浮沉淀2～5 min,使菌体溶解；接着置于浮漂上,100 ℃煮沸8～10 min,以12000 r/min再离心8～10 min,弃去沉淀,收集上清液(即提取的基因组DNA)于离心管中,作为PCR反应基因组DNA模板,在-80 ℃保存备用。

1.2.5 ERIC-PCR分型 参考Appuhamy S[10]报道的ERIC-PCR基因分型方法,引物选用James V[11]报道的ERIC1(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′)。PCR反应体系(25 μL)包括：2×PCR Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 7.5 μL,ERIC1 2 μL,模板2 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性10 min;94 ℃变性30 s,49 ℃退火35 s,72 ℃延伸2 min,35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取5～10 μL PCR扩增产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳观察,使用NTSYSpc 2.1软件对电泳条带进行分析[12],凡相似度大于85%者视为同一谱型,代表同一克隆株。根据不同耐药菌株在不同谱型的分布情况,分析耐药菌株间的遗传关系。

1.2.6 菌株保存 副猪嗜血杆菌极易死亡,对临床分离株及时冻干(10%脱脂奶混悬),于-80 ℃冰箱保存。

2 结果和分析

2.1 细菌分离纯化、鉴定结果

分离菌株在TSA平板上长势良好,可以看到湿润、隆起,呈灰白色、半透明色、边缘整齐、大小不一的菌落形态。在油镜观察下,细菌呈短杆状,也有细长杆状,单个或短链排列,无芽孢,为革兰氏阴性菌,见图1。

16s RNA的PCR扩增片段预计在831 bp,扩增结果证明分离临床菌株为HPS,部分结果见图2。

图1 油镜下的HPS革兰氏染色形态

2.2 副猪嗜血杆菌分离结果及药敏试验结果

从7个省份323份疑似副猪嗜血杆菌典型病变的病料中分离出104株,分离率为32.2%，其中河南26株,湖北19株,江西13株,湖南10株,安徽13株,山西11株,陕西12株。药敏试验结果显示:所有菌株都对痢菌净和沃尼妙林敏感,而对其他抗生素有不同程度的耐药性。对复方磺胺-5-甲氧嘧啶钠的耐药率最高(表1),为93.3%;其次是四环素、环丙沙星,耐药率分别为51.9%、51.0%；对β内酰胺环类的氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟的耐药率分别为39.4%、5.8%和1.9%；对林可霉素、卡那霉素、甲砜霉素和红霉素的耐药率分别为26.0%、10.6%、13.5%、37.5%。

M:DNA分子量标准;1:阳性对照;2:阴性对照;3～8:临床分离株的PCR产物。

在供试的12种抗生素中,104株临床分离株耐2～5种抗生素居多,达到69.2%；分别有4株、2株对6种、7种抗菌药耐药；只有4株不对任何一种抗生素耐药；2株仅对四环素耐药。具体情况见表2。

由于分离菌株对四环素、环丙沙星、林可霉素、氨苄西林、红霉素及复方磺胺-5-甲氧嘧啶钠的耐药率较高,所以分析HPS对这6种抗菌药在7个省份之间的耐药性差异。SPSS差异显著性分析结果显示:除河南省和湖南省间的红霉素耐药率差异达显著水平(P=0.027<0.05)外,其它药物在7个省份之间的耐药率差异均不显著(P>0.05),具体结果见图3、表3。说明7个省份之间各类抗生素耐药情况虽有一定的差异,但大多数差异不明显。

2.3 ERIC-PCR分型结果

利用NTSYSpc 2.1软件,对104株临床分离株进行ERIC-PCR分型,其中5株不能分型，99株可以分型,分型结果如图4所示。对99株临床分离株分型结果按80%的相似性可分为18个ERIC-PCR谱型。其中,包含菌株最多的谱型为XIII型，有25株;其次为VI型,有18株;最少的为I、IV、V、XIV、XVII、XVIII型，均只有1株；II、III、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XV、XVI型分别有2、2、9、13、13、2、2、4、3、3株。

表1 104株HPS临床分离株的MIC分布

注:TET,四环素;CIP,环丙沙星;LN,林可霉素;AMP,氨苄西林;CTX,头孢噻呋;CTC,头孢喹肟;KM,卡那霉素;THI,甲砜霉素;MEQ,痢菌净;VAL,沃尼妙林;ERY,红霉素;SMD-TMP,复方磺胺-5-甲氧嘧啶钠。下同。

表2 104株临床分离株的耐药种类

图3 7个省份临床分离株对6种抗生素耐药的差异

表37个省份临床分离株对6种抗生素的耐药率%

省份四环素环丙沙星林可霉素氨苄西林红霉素复方磺胺-5-甲氧嘧啶钠河南46.265.434.642.357.7A92.3湖北47.442.121.142.136.889.5江西53.853.830.846.246.292.3湖南40.050.040.020.010.0A100.0安徽61.538.515.430.830.8100.0山西45.036.49.127.327.381.9陕西75.058.325.058.333.3100.0

注:“A”代表P<0.05,即差异显著。

分离菌ERIC-PCR分型与对6种药物耐药表型关系的分析结果见表4,从中可以看出,除耐林可霉素的菌株较均匀地分布于12个ERIC-PCR型外,耐其它5种药物的菌株大多集中(8株以上)分布于2个(氨苄西林)或3个ERIC-PCR型中,这表明本试验中的耐林可霉素的菌株多数来自不同的克隆,其耐药性可能以水平传播为主；而耐其他5种药物的菌株多数遗传关系很近,来自同一克隆,只有少数来自不同的克隆。

3 讨论

HPS为兼性厌氧菌,对营养要求苛刻,临床分离难度大,因而对分离和培养的要求高。使用TSA和TSB含量高的培养基,培养24 h内即可长出肉眼可见的菌落,具有较高的分离率。我们于2015年10月到2017年5月,历时近2年对7个省份323份疑似副猪嗜血杆菌典型病变的病料(病死猪肺脏、脾脏、淋巴结)进行了病原菌的分离,发现脾脏、淋巴结等部位较难分离,而病料在猪死亡后24 h内送检的,在死亡前有呼吸道症状并有肺脏病变的肺脏及气管相对容易分离到该菌。文献报道关节液、心包液病原菌分布度较高[13],相对容易分离,但这些部位送检采样较困难。本次试验仅分离出HPS 104株,分离率较低(为32.2%),这可能与外省部分病料在猪死亡较长时间后送检有关。故应尽可能尽早采样进行细菌分离。

图4 部分菌株的ERIC-PCR分型结果

抗菌药物ERIC-PCR型IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXIXIIXIIIXIVXVXVIXVIIXVI-II四环素10110134832211113111环丙沙星0011117395132801001林可霉素011105251011612000氨苄西林11011101131000711210红霉素000109292012902200复方磺胺-5-甲氧嘧啶钠011101675101312313301

本次药敏试验结果显示:所有分离菌株都对痢菌净和沃尼妙林敏感,这可能与这2种药物较少使用有关,也显示出沃尼妙林治疗HPS感染的良好潜力。但分离菌株对其他抗生素均有不同程度的耐药性,其中,高达93.3%的分离菌对复方磺胺-5-甲氧嘧啶钠耐药,这一结果高于国内外研究报道的HPS对复方磺胺的耐药率[14-16],说明复方磺胺对治疗采样猪场的HPS感染几乎无实际价值。有半数以上的菌株对四环素、环丙沙星耐药(耐药率分别为51.9%、51.0%),另有20%以上的菌株对氨苄西林、林可霉素和红霉素耐药(耐药率分别为39.4%、23.1%、37.5%),这些结果与国内有关研究结果[14-15,17-18]相近或略高，但显著高于国外的研究结果(0%)[16,19]。但分离菌对头孢噻呋、头孢喹肟、卡那霉素、甲砜霉素的耐药率较低,这为猪场的合理化用药提供了科学依据。因此临床根据药敏试验结果合理选药,能有效治疗HPS感染。应该看到,耐多种药物的菌株比例较高(耐3种以上药物的菌株占总分离菌的56%),最常见的耐药谱是耐药3～5种(表2),说明耐多种药物的菌株较为普遍。本试验对7省分离株的耐药差异情况分析显示:6种抗生素耐药率的地区差异多数并不显著(图3、表3),这可能与规模化猪场所用抗菌药种类相近有关；但耐药谱型并不相同,故不同地区猪场仍应当加强耐药性监测,以及时调整日常治疗用药方案。

与肠杆菌科细菌对3代头孢具有高的耐药率不同,HPS分离菌对3代头孢的耐药率通常很低。在本试验中，HPS分离菌对头孢的耐药率较低,分别有5.8%、1.9%的HPS分离菌对头孢类的头孢噻呋、头孢喹肟耐药,这与国内外的有关研究报道[17,19]相似。但值得注意的是,目前已报道的嗜血杆菌属细菌对β-内酰胺环类的耐药机制,主要是产生β-内酰胺酶(TEM-1、Rob-1)和染色体ftsI基因突变[20],但这两种机制均不介导对头孢类的耐药性,故HPS对头孢类耐药的分子机制显然值得重点研究。

细菌的基因分型(genotyping),亦称分子分型(Molecular typing)或流行病学分型(epidemiological typing)，是研究耐药菌之间遗传相关性的重要手段,国外在研究细菌耐药性或耐药基因传播扩散中普遍应用基因分型。细菌的基因分型方法很多,主要包括:随机多态核苷酸序列(RAPD)分析、肠杆菌基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)、基因外重复回文序列PCR(REP-PCR)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点核酸序列测定(MLST)等。PFGE和MLST结果准确,被誉为分子流行学分析的“金标准”[21],但耗时、费用高,PFGE还对技术设备的要求高,故限制了这两种方法在临床上的大规模应用。RADP图谱中某些弱带重复性较差，并常有假阳性或假阴性结果。REP-PCR虽然操作方便快捷,但重复性差,有时分辨率低。本文选用的ERIC-PCR分型方法,具有操作简单、成本低[22]、周期短、分辨效果较好、可重复性好、实验设备易用等优点,有利于基层进行分子流行病学的监测[23]。本试验对104株临床分离株进行ERIC-PCR分型的结果显示:除耐林可霉素的分离株几乎均匀地分布在12种ERIC型中外,耐其他5种药物的菌株有的比较集中地(8株以上)分布于2～3种ERIC型中,又有部分菌株均匀地分布在9～13种ERIC型中,尤其耐复方磺胺-5-甲氧嘧啶钠的菌株高达45株集中分布在VI、IX和XIII型ERIC型中,说明耐上述药物的菌株既有来自同一克隆的,又有来自不同克隆的,HPS对这几种药物的耐药性既有垂直传播又有水平传播,而对林可霉素的耐药性以水平传播为主,对复方磺胺的耐药性以垂直传播为主。这为进一步研究临床分离株耐药基因的传播扩散机制提供了重要的信息和有益参考。

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