食源性致病菌的检测技术研究进展

苏粉良，李冰燕，陈雨欣，周 雯

（1.苏州大学医学部，江苏苏州 215006；2.苏州出入境检验检疫局，江苏苏州 215004）

0 引言

食品安全是全世界共同关注的公共卫生问题，由细菌导致的食物中毒的数量占各种食物中毒之首，食源性疾病已经成为危害食品安全最主要的原因之一[1-2]。常见的食源性致病菌有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、出血性大肠杆菌O157∶H7、空肠弯曲菌、阪崎克罗诺杆菌等。这些致病菌在食品中存活、生长代谢引起食品变质，同时有些致病菌分泌有毒物质，直接或间接导致患病。因此，应用准确有效的检测技术来控制食源性疾病的流行具有非常重要的公共卫生学意义。

1 食源性致病菌的检测方法

1.1 传统的细菌培养技术

作为食品微生物检测的“金标准”，传统的细菌培养技术在食源性致病菌检测方面具有举足轻重的作用。目前，食品安全国家标准里均有致病菌传统的培养鉴定技术要求。其基本原理为称取一定数量的待检样品，通过（选择性）增菌液富集培养，后划线分离到选择性培养基，观察菌落形态。挑取典型菌落染色镜检、做后续的生化鉴定和血清学分型。随着生物技术的不断发展，灵敏度高、特异性强显色培养基投入到检测过程，有效提高了筛选效率。在后续的生化鉴定过程中，全自动微生物鉴定分析系统的使用可以简化试验步骤、缩短试验周期，并且能更高效地得出试验结果。

但是，传统的细菌培养技术试验周期比较长、步骤比较繁琐，在突发公共卫生事件中该技术无法做到高通量快速检测，不能起到有效的监测、预防作用，并且在试验结果的判定方面对检测人员的要求比较高。此外，对于一些在食品加工过程中受损的致病菌（活的不可培养状态）、持留菌、休眠菌及代谢异质菌来说，传统的细菌培养技术还是存在一定的缺陷，会导致这种类型致病菌的漏检[3]。

1.2 免疫学技术

免疫学技术是指抗原与相应抗体特异性结合会产生相应的信号，通过监测该信号来判断待检样本中是否有目标物质。

1.2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验应用了抗原抗体之间特异性反应的原理，在检测过程中通过酶标抗体（抗原）催化底物显色来对待检样品进行定性或定量分析。多名专家应用该方法对不同的细菌进行试验研究，结果表明酶联免疫吸附试验能在24 h内检测多种食源性致病菌。例如，应用酶联免疫吸附原理制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪可在1～2 d内快速筛检沙门氏菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌和空肠弯曲菌等[4]。

1.2.2 免疫层析技术

免疫层析技术以固定有检测限和控制限的条状纤维层材料为固定相，测试液为流动相，由于毛细管作用原理，样品溶液在层析条上泳动，当样品移动到包埋有抗体的地方时，样品中相应的抗原就会与该抗体发生特异性结合发生免疫反应，通过酶反应或者是直接运用可目测的标记物（如胶体金、彩色乳胶等）得到试验结果。免疫层析技术包括胶体金免疫层析技术、碳纳米颗粒免疫层析技术、荧光微球免疫层析技术和量子点免疫层析技术[5]。其中，胶体金免疫层析技术是在20世纪80年代初发展起来的，具有快速、简单、低价、适应性广等优点[6]，适合基层单位进行各种食源性致病菌的快速筛查。国内外不少人研制胶体金试纸条，并用于食源性致病菌的检测[6]。黄岭芳等人[7]用该方法检测食品中的大肠杆菌O157，最低检测限为1×104CFU/mL。

1.2.3 免疫磁珠分离技术

免疫磁珠分离技术是将特定致病菌的抗体偶联到磁珠微球上并通过抗原抗体反应形成磁珠，通过外部磁场磁力的作用，将目标致病菌分离出来的技术。目前，免疫磁珠分离技术可以与多种技术联合使用来实现对食源性致病菌的快速检测[8]。比如，结合显色培养基分离技术、PCR技术、免疫学技术、电化学技术、流式细胞仪分析等，这样不仅可以节省检测时间，还可以对样品进行高通量筛检。随着免疫磁珠分离技术的不断发展，目前研发人员已经建立了一些不需要扩增培养就可以检测目标菌的技术方法，时间可以控制在3 h以内，从而真正地实现了致病菌快速检测[9-11]。

1.2.4 其他免疫学技术

除以上3种免疫学检测技术以外，免疫扩散技术、免疫荧光技术、免疫印迹技术、乳胶凝集法等都在食源性致病菌检测中有所应用[12]。

免疫学技术具有特异性好、效率高、检测成本低、不需要大型仪器等优点，但是当待检食品中含有目标菌的竞争性物质时则很有可能出现假阳性结果，灵敏度不高，这些因素限制了免疫学技术在食源性致病菌检测中的广泛应用。

1.3 分子生物学技术

分子生物学检测技术的发展，为食源性致病菌生物快检工作提供了良好的技术平台。

1.3.1 聚合酶链式反应技术（PCR技术）

PCR技术检测食源性致病菌是指将目标菌DNA为模板，先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的2条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以4种脱氧核糖核酸（dNTP） 为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使目标菌的DNA扩增，然后通过电泳检测PCR产物是否有特征条带，从而实现为目标菌的快速检测。近年来，用PCR技术在食源性致病菌领域发展很好，检测方法也多样化，如普通PCR、实时荧光定量PCR、逆转录PCR和电化学发光PCR[13]等，也可将几种方法结合使用[12]。目前，国内有很多PCR方法已经变成检测标准，以出入境检验检疫行业标准为多。

1.3.2 生物芯片技术

生物芯片技术是由生命科学与微电子学等学科相互交叉发展起来的一门高新技术，生物芯片直接检测致病菌的DNA，可以解决复杂样品中存在酶抑制物的问题，与传统的生物检测技术相比具有信息量大、处理快速、所需样品少、污染少等优点[14]。目前，生物芯片技术应用最成功的是基因芯片。

应用基因芯片检测致病菌原理是基于细菌的16S rRNA基因的高度保守性。由于16S rRNA基因的长度最合适，是目前最常被选用作细菌的分类和鉴定的基因[15]。李君文等人[16]曾经用基因芯片检测水中常见的致病菌，并可对水中致病菌实行高通量检测，通过一次试验可以得出全部结果。

1.3.3 DNA探针技术

DNA探针是经过某种标记物（放射性同位素、酶、荧光素、化学发光物、镧系元素等） 标记过的单链DNA[17]，它在体外合适的条件下按照碱基互补配对的原则，与靶DNA形成杂交DNA分子，通过检测杂交信号来判断样品中是否含有待测致病菌。通常选择待测致病菌的特异性保守基因序列为目标DNA，并以其互补DNA序列为杂交探针。DNA探针的特异性，保证了检测结果的高度特异性[18]。

分子生物学技术特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点逐渐被人接受，但是不可忽视的是该技术容易出现假阳性和假阴性，而且仪器和试剂耗材费用较大，另外操作人员需要经过专业培训上岗等因素限制了其广泛应用。

1.4 生物传感器技术

生物传感器技术是一种由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透形成起来的高新微量分析技术生物。生物传感器主要由生物分子识别元件和信号转换元件2个部分组成，其基本原理为:当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物（或光、热等）通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的[19]。通过生物传感器技术，能够检测出食品中低浓度病原菌，并且适合对食品进行实时监测[20]。该技术已经被用到食源性致病菌的检测工作当中。Luo Jinping等人[21]曾用生物传感技术来检测牛肉汁中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；2002年，Tahir Z M等人[22]采用电化学免疫传感器技术在10 min内完成大肠杆菌O157∶H7的检测分析，并且精度达到10 CFU/mL；2014年，叶雪梅等人[23]用生物传感器检测食品中的沙门氏菌，并做了传感器持久性的研究。武会娟等人[24]采用免疫生物传感器检测食品中的单增李斯特菌，花费时间4.5 h，检出浓度达100 CFU/孔。

生物传感器的好处是需要的检测样本量少、检测结果灵敏度高、重复性好。但是目前仍处于研究阶段，且检测费用高，不利于推广[25]。

1.5 代谢学检测技术

代谢学检测技术的原理是在培养基中繁殖食品微生物，通过研究其在代谢过程中产生的特异物质、分子等变化特征，间接获取食品微生物量化结果。代谢学检测技术包括三磷酸腺苷（ATP） 生物发光法、电阻抗技术、微量生化法。

1.5.1 ATP生物发光法

ATP是细胞内必需的一种代谢产物，在一定条件下细胞内ATP含量比较稳定，因此通过测定细菌的ATP含量可间接计算出样品中的活菌数。该法常用来检测活细菌总数，反映食品受污染的严重程度，具有简便、省时、快速等特点，还可以被用于大量食品样本中菌污染情况检测和食品现场快速检测等。但是，若样品中含有大量非细胞性ATP，则检测结果可受干扰[26]。

1.5.2 电阻抗技术

电阻抗技术是根据微生物在培养基中代谢活动的不同，通过电阻抗测量法对微生物进行鉴定的技术。工作原理为：细菌在生长繁殖过程中，会把培养基中的大分子物质，如碳水化合物和蛋白质等代谢为小分子的乳酸盐和氨基酸等，培养基的导电性就会随之发生变化，因此可以通过检测培养基导电性的变化情况来判断细菌在培养基中的繁殖特性[27]。目前，电阻抗法已被AOAC接收，适用于检测食品中的病原体，目前可用于食品中细菌总数、大肠杆菌和沙门氏菌等的检测，该方法较常规方法敏感、快速，而且特异性高、重复性好[28]。

1.5.3 微量生化法

微量生化法包含微热量技法、放射测量法等。微热量技法是指通过测定细菌生长代谢时的热效应来检测细菌，可以通过热量变化来鉴别菌种；放射测量法原理是细菌在生长繁殖过程中代谢含14C标记的碳水化合物进行并释放出含有放射性的14CO2，然后通过测定放射性的14CO2含量而测定食源性致病菌。Previte J J[29]曾经应用放射测量技术来检测食品中微生物，由于该方法应用到了放射性物质，在应用上有很大的限制。

1.5.4 基于气味指纹技术的电子鼻方法

微生物在代谢过程中会产生特定的代谢产物，不同的微生物，其产生的挥发性代谢产物往往不同。但是，它们一般具有种属特征，因此可以根据这些气味物质和由它们组成的气味指纹图谱来进行不同微生物的鉴定与检测。由于该方法主要是针对微生物的挥发性代谢产物，因此对样品没有什么特殊的要求。除了检测迅速、灵敏度高外，该法最主要的优点是无需对样品进行任何处理,因此在微生物无损检测方面具有很好的应用前景[30]。

1.6 其他检测技术

随着现代生物技术的不断发展，先进仪器的使用也为食源性致病菌检测提供了良好的技术平台。其中基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）是最近发展起来的一种鉴定食源性致病菌的仪器。目前，已有许多应用MALDI-TOF-MS技术进行食源性致病菌鉴定的相关报道。有人曾应用MALDI-TOF-MS技术成功鉴定区分了金黄色葡萄球菌、致泻性大肠埃希氏菌、志贺氏菌、黏质沙雷氏菌、肠炎耶尔森氏菌、芽孢杆菌属等31株常见食源性致病菌。

流式细胞术是能够用来快速检测液相中悬浮粒子多种物理特性的一种现代分析方法。因其具有分析速度快和灵敏度高等优点，该方法正逐渐被应用于食源致病菌的检测。但是该方法使用的试剂成本高、人员技术难度大、受检样品局限，难以普及推广，因此目前只适用于科研和医疗机构[31]。

2 结语

食源性致病菌检测是食品安全的一个重要方面，随着生物技术的不断发展，食源性致病菌检测技术也在不断地出现。在实际的食品检测过程中，使用最为广泛的还是传统的培养鉴定技术，同时也会使用一些快速检测手段，如VITEK，mini-vidas等仪器或生化鉴定试剂条等辅助检测。快速检测手段可以用于突发的公共卫生事件或者是批量化筛检。在快速检测技术中，分子生物学技术中的PCR技术是目前研究的最深入、最成熟的检测技术，应用得也较为广泛，该方法已经有相应的国标[32]。免疫学技术主要以试剂盒或是试纸条等产品的方式应用于检测工作，但是由于其灵敏度不高等缺点没有得到广泛的应用。其他一些快速检测技术仍处于试验研究阶段，并未得到推广应用。综合来看，每种检测技术都有其自身的缺陷，但是随着多种学科的共同发展，多种检测技术联合使用将会大大提高检测的准确性，缩短检测时间，在食源性疾病的预防和控制的方面发挥至关重要的作用。

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