辣木叶渣中非水溶性蛋白及酶解效果研究

施娅楠，和丽菊，赵存朝，黄艾祥

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201）

辣木（Moringa oleifera Lam.）是一种多年生木本植物，原产于印度西北部，具有生长速度快、耐高温、耐旱的特点[1-4]，辣木以其高蛋白质、低脂肪、高纤维素、维生素的健康特性和降血糖、抗菌消炎、强心的保健效果而成为健康食品界的新宠，2012年被中国绿色食品发展中心认定为“国家首推绿色食品”，如今在发展中国家广泛种植[5-10]。辣木蛋白是一种优质蛋白，叶中蛋白含量在27%～37%，其中约80%谷蛋白，14%醇溶蛋白，3.5%白蛋白和1%球蛋白[11]，因此，约90%以上的叶蛋白为非水溶性的谷蛋白和醇溶蛋白，谷蛋白分子内存在巯基和分子之间的二硫键，结构决定其不溶于中性盐溶液而只溶于稀酸、稀碱；醇溶蛋白疏水性较强，使得辣木蛋白在弱碱提、弱酸提或盐溶后仍被保留在叶中[12]，因此，辣木蛋白溶解、乳化性能不佳等原因，多作为动物饲料使用，造成蛋白资源的极大浪费[13]。酶法可破坏蛋白质与其他非水溶性物质结合，且蛋白多肽链可水解为短肽链从而提高蛋白质溶解性，并对其他功能特性产生一定的作用[14-18]。本研究从蛋白资源开发和辣木叶资源的充分利用两方面考虑，开展从辣木叶渣中提取非水溶蛋白，旨在能将蛋白充分提取并适当改性后，增强蛋白消化吸收性、以期加工成食用乳化剂、起泡剂、胶凝剂和多肽类产品。

1 材料与方法

1.1 材料

辣木叶粉：云南德宏州天佑科技开发有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、R-250、甘油、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、TEMED、Tris-Hcl、溴酚蓝（分析纯）、果胶酶（500 U/mg）、木聚糖酶（6 000 U/mg）、复合植物水解酶（200 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）：Sigma公司；盐酸（食品级）：北京化工试剂厂。

1.2 仪器

UV765PC紫外分光光度计、DHG-9070A真空冷冻干燥机：上海精密科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器公司；TGL20M高速冷冻离心机：湖南湘立科学仪器有限公司；超声波萃取仪：上海力申科学仪器有限公司；Bio-rad 164-5052电泳仪：BIO-RAD；I99161pH计：纳沃德仪器（北京）有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：海博讯实业有限公司；8-2磁力搅拌器：北京世纪阳光科技发展有限公司；XH微型漩涡混合器：上海跃进医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

辣木叶渣的制备为了最大可能地去除辣木叶水浸出物，去除水溶性蛋白质，采用0.08 mol/L碱液提取，料液比1∶80（g/mL）提取浸提2次，每次超声时间30 min，测蛋白含量，叶渣55℃烘干保存；叶渣在最适酶解条件下4℃涡旋振荡10 min，真空浓缩至原10倍体积，加入浓缩液4倍体积的75%预冷乙醇溶液，-4℃沉淀过夜，真空冷冻干燥得辣木蛋白干粉（-20℃保藏）。

1.3.2 单因素试验

以辣木叶渣蛋白质的提取率为指标，研究水解酶种类、酶用量、酶解温度、时间4个因素变量。设置酶种类为果胶酶、复合植物水解酶、木聚糖酶、碱性蛋白酶；酶用量 0.3%、0.8%、1.3%、1.8%、2.3%；酶解温度 40、45、50、55、60 ℃；酶解时间 40、50、60、70、80 min。

1.3.3 响应面优化提取条件

在单因素试验结果的基础上，以酶的添加量、酶解时间、酶解温度为试验因素，进行响应面试验，优化辣木叶渣蛋白提取率的工艺参数，响应面试验设计及结果见表1。

表1 试验因素水平Table 1 Level of experimental factors

1.3.4 蛋白质提取率

以标准蛋白质含量（μ/g）为横坐标，吸光度为纵坐标，以牛血清白蛋白作标准蛋白，在波长595 nm处绘制标准曲线，标准曲线回归方程如下：

式中：C为蛋白质质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为提取液稀释倍数；M为辣木叶渣质量，g。

1.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳

1.3.5.1 制备样品

分别取100 mg辣木叶蛋白质干粉样品溶解在100 mL，100 mmol/L，pH6.5的磷酸缓冲溶液中，加入0.1%的NaN3，低温加热，漩涡振荡3 min使之溶解，离心（8 000 r/min，2 min），备用。

1.3.5.2 配制5×电泳缓冲液、固定液、染色液、脱色液等电泳使用相关溶液

将配置好的样品和上样缓冲液混合，按样品：载样液=4∶1（体积比）的比例配制成1 mL的溶液后摇匀，沸水浴加热10 min制得电泳样，于4℃冰箱保存备用。

1.3.5.3 配胶

取绿色夹板固定薄厚玻璃板，支架固定好夹板，准备装分离胶和浓缩胶（预试验确定分离胶浓度为15%），制备分离胶时小心避免产生气泡，迅速在胶上部加超纯水，使凝胶表面变得平整，待胶凝固30 min，弃去水层用滤纸将多余的水吸干，灌注浓缩胶，直至凝胶溶液达到玻璃板的顶端，立即插入梳子，待胶凝固30min。

1.3.5.4 电泳

移液枪小心将蛋白marker、电泳样依此加入到凹槽内，加入适量的5×电泳缓冲液，链接电源，设定浓缩胶电泳条件为50 V恒压30 min，分离胶电泳条件为120 V恒压约1 h，等溴酚蓝跑至凝胶底部，关闭电源。

1.3.5.5 电泳胶片的处理

电泳结束，取下胶片，依次对电泳胶片进行固定、染色、脱色、扫描分析。

固定：电泳结束，将电泳胶片从夹板上取出，切去浓缩胶后，放入30%的乙醇溶液中固定30 min。染色：将固定好的胶片，转移到考马斯亮蓝G-250染液中染色，放置于摇床上均匀染色，5 h。脱色：染色结束后，用20%的甲醇或超纯水进行脱色，多次洗脱至条带清晰可见。扫描：将脱色后的胶，放在扫描仪上扫描，放胶时注意避免产生气泡。

2 结果与讨论

2.1 提取工艺参数

2.1.1 酶种类对蛋白提取率的影响

不同水解酶对辣木残渣蛋白提取的影响见图1。

图1 不同种类酶对残渣蛋白提取率的影响Fig.1 The effect of enzyme species on the residual protein extraction rate

由图1可知，不同水解酶对辣木叶渣蛋白质提取率的影响：碱性蛋白酶>木聚糖酶＞复合植物水解酶＞果胶酶，由于不同种类的水解酶的作用于蛋白质的机理和酶催化动力学特征不同导致提取效果有明显不同。碱性蛋白酶的提取效果在所选4种酶制剂中最好，提取率达36.4（mg/g），辣木叶中多糖含量极高，碱性蛋白酶可使叶渣中多糖结构变得松散，对蛋白质和多糖的分离起到了促进作用[17]，同时碱性蛋白酶是一种内切肽酶，能够水解多种蛋白，提取率相对较高，且售价合理。所以，本试验采用碱性蛋白酶。

2.1.2 酶的添加量对蛋白提取率的影响

酶添加量对辣木残渣蛋白提取的影响见图2。

图2可知，碱性蛋白酶用量1.8%（E/S）时，提取率达34.7（mg/g）。随着酶用量的增加，提取率反而下降，这是因为蛋白质受到酶的过度水解，空间结构受到破坏，与考马斯亮蓝结合的疏水区减少，所以酶用量提高而蛋白提取率下降。同时，把已水解的蛋白质水解成更小的肽[20]，而蛋白质含量并没有增加，提取率反而降低。

图2 酶添加量对残渣蛋白提取的影响Fig.2 The effect of enzyme dosage on the residual protein extraction rate

2.1.3 酶解温度对蛋白提取率的影响

酶解温度对辣木残渣蛋白提取的影响见图3。

图3 酶解温度对残渣蛋白提取的影响Fig.3 The effect of enzyme hydrolysis temperature on the residual protein extraction rate

在碱性蛋白酶用量1.8%（E/S）的条件下提取蛋白质，该酶理论最适作用温度为50℃～60℃，由图3可知，本试验最适作用温度为55℃，温度继续升高时，酶活性降低，蛋白提取率降低，当温度高于55℃，尤其是具有催化活性的四级结构发生变化，易变性，同时由于疏水基团的暴露和展开、蛋白质分子的聚集，使叶渣中的蛋白质溶解度下降，导致酶提时蛋白质提取率下降[12]。

2.1.4 酶解时间对蛋白提取率的影响

酶解时间对蛋白提取率的影响见图4。

图4 酶解时间对残渣蛋白提取率的影响Fig.4 The effect of enzyme hydrolysis time on the residual protein extraction rate

在碱性蛋白酶用量1.8%（E/S），酶解温度55℃的条件提取蛋白质，由图4可知，提取的时间越长，提取率越高，在60 min～70 min内，增长速率很快；当时间达到70 min后，随着时间的延长，蛋白质的提取率变化不大，且缓慢减低，蛋白酶催化植物蛋白质水解时是通过催化肽键的断裂来发挥作用的，其作用于肽链内部的肽键，生成长度较短的多肽链，使得大分子蛋白的质量降低，得到小分子蛋白[16]。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应试验设计及结果

进行响应面试验，优化辣木蛋白的提取率参数，试验设计及结果见表2。

表2 响应面分析方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 显著性检验

利用Design-Expert8.0.6软件对表2进行多元回归拟合，得到辣木蛋白提取率对X1酶的添加量（%）、X2酶解时间（min）、X3酶解温度（℃）的回归模型方差分析表。模型的方差分析结果如表3所示。

利用Design-Expert 8.06软件对表2试验数据进行二次多项式回归拟合，得到蛋白质提取率X1酶的添加量（%）、X2酶解时间（min）、X3酶解温度（℃）的回归模型方程为：蛋白提取率Y=36.63-0.35X1-0.53X2-1.08X3-0.20X1X2+0.12X1X3-0.35X2X3-4.22X12-1.87X22-3.68X32。

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis results

从方差分析可以看出，回归模型F=174，97，P＜0.01，表明二次多元回归模型显著；失拟项F=0.78，P=0.560 3＞0.05，模型失拟不显著，说明未知因素对结果的影响非常小，试验误差主要来源于随机误差。回归诊断表明，决定系数R2=0.439 5，信噪比Adeq precisior=24.326。这表明方程的拟合和可信度高，可用于预测辣木中可溶性蛋白的提取。CV（Y变异系数）表示试验本身的精度，CV值越小，试验的可靠性越高，本试验中CV比较低，为0.28%，表明试验操作的可信度高，具有实用性指导意义。通过回归系数的绝对值分析了每个因素对辣木蛋白提取变化的影响，检验可知：X22的影响显著（P＜0.01），X12，X32的影响极显著（P＜0.001）。据F值可知，各个因素对辣木蛋白的提取率影响的大小顺序为：X3酶解温度＞X1酶的添加量＞X2酶解时间。

2.2.3 响应面优化提取条件

X1酶的添加量（%）、X2酶解时间（min）、X3酶解温度（℃）可以通过观察图5中的响应面的变化和轮廓线的稀疏度来衡量蛋白提取率的影响。当轮廓为圆形时，两个因素之间的相互作用不显著，而椭圆形或鞍形形状显示两个因素之间的相互作用是显著的。各因素交互作用对辣木蛋白提取影响的响应面图见图5。

图5可以表明：交互项X1X2、X1X3、X2X3影响极显著（P＜0.01）。而且 X1、X2、X3之间的相互作用的变化是陡峭的，表明每个因素对辣木提取率的影响大，与方差分析一致。其中等高线呈名的椭圆形和马蹄形，说明这4个因数的相互作用是显著的，对辣木蛋白的提取率影响较大。

图5 各因素交互作用对辣木蛋白提取影响的响应面图Fig.5 Response surface graph interactive effects of various factors on the protein extract of Moringa oleifera

2.2.4 最佳条件的确定和回归模型的验证

通过响应面法得到辣木叶渣中蛋白的最佳提取工艺为碱性蛋白酶添加量1.4%，酶解温度为54.5℃，酶解时间为68.4 min，此条件提取率为（35.88±1.73）mg/g。实际操作中稍作调整确定的最佳工艺条件为碱性蛋白酶添加量1.8%，酶解温度为55℃，酶解时间为70 min，在此条件下进行验证试验，得到的蛋白提取率为（34.92±1.42）mg/g与理论值接近，说明模型与实际相符，具有实际应用的价值。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

辣木叶总蛋白质在非还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱见图6，酶解后蛋白电泳图谱见图7。

图6 总蛋白的电泳图Fig.6 Electrophoresis profiles of total proteins

酶解前在高分子区域有25 KD～100 KD蛋白谱带，其中55 KD～100 KD属于高分子量醇溶蛋白，75%预冷乙醇条件下部分醇溶蛋白被提取出来[22-23]。25 KD～55 KD谱带为低分子量谷蛋白，其中25 KD～30 KD，55 KD为主要辣木叶谷蛋白，0.08 mol/L碱液可以将此部分蛋白提取出来，图6区域显示的蛋白可能是通过分子间二硫键交链形成的，使得这部分蛋白质在水或0.15 M氯化钠提取过程中不能溶出[22-23]。

酶解条件下的凝胶电泳条带见图7。

图7 酶解后蛋白电泳图谱Fig.7 Electrophoresis profiles of the protein after enzymatic hydrolysis

通过添加量为1.8%的碱性蛋白酶，辣木叶中非水溶性蛋白在酶解过程中发生降解，形成分子在15 KD以下的小分子蛋白，其原因是，酶法可破坏蛋白质与其他非水溶性物质结合，且蛋白多肽链可水解为短肽链从而提高蛋白质溶解性，并且降解成为原先不存在的小分子蛋白。

3 结论

响应面分析法建立辣木叶渣中非水溶性蛋白提取的二次回归模型，建立的最佳参数为碱性蛋白酶添加量1.8%，酶解温度为55℃，酶解时间70 min，提取率为（34.92±1.42）mg/g。电泳结果显示疏水作用、二硫键连同其它形式的共价键共同作用，使蛋白质发生聚集导致溶解性降低，酶解后蛋白质高分子量亚基的谷蛋白和醇溶蛋白基本消失，在低分子区域形成15 KD以下的蛋白谱带。

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