响应曲面法优化茶树总黄酮提取工艺的研究

秦文文，刘宇，李妹妹，郝宝成，王学红，尚若锋，黄鑫，衣云鹏，梁剑平

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点试验室，甘肃省新兽药工程重点试验室，甘肃兰州730050）

茶树（Teatree），又叫互叶白千层（Melaleucaalternifolia），桃金娘科（Myrtaceae）白千层属（Melaleuca）植物，是一种短期栽种培育就可投入利用的经济林木[1-3]。据文献报道，茶树中含有多种黄酮类化合物，黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如向天果、槐米中的芦丁和陈皮中的陈皮苷，它们具有多种生物活性和药理作用[4]。在医药方面，黄酮类化合物具有心血管系统活性，如芦丁、槲皮素、葛根素等具有明显的扩冠作用并且对缺血性脑损伤有保护作用；黄酮类化合物具有抗菌及抗病毒活性，如木犀草素、黄岑素等具有抗菌作用，槲皮素等具有抗病毒作用，从菊花中分离得到的黄酮单体及鸡豆黄素A对人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）均有一定的抑制作用；此外，研究发现黄酮类化合物还具有抗炎抗肿瘤及抗氧化自由基等方面的生物活性[5]。在食品工业方面，主要将黄酮类化合物作为功能因子开发一些保健食品，用于提高机体的免疫力。

目前，国内外对茶树的开发利用基本上以其精油为主，对其黄酮类化合物的化学成分及药理作用的研究和开发相对较少。在实际生产中，提取完精油的茶树枝叶通常作为废料处理[6]。本试验以广东茶树枝叶为原料，以茶树总黄酮得率为响应值，利用超声波辅助提取茶树总黄酮[7-12]，并采用Box-Behnken对超声波超声时间、超声温度、乙醇浓度、料液比进行响应面优化。通过对茶树总黄酮的提取工艺的研究，旨在为茶树中黄酮类化合物的开发利用提供理论依据，以便实现茶树资源的综合利用。

1 材料、试剂与仪器

KH3200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-6000A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；AL204电子秤：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；IKA MVP 10 basic真空泵：兰州同正生物技术有限公司；DHG-9070电热恒温鼓风干燥箱：上海鸿都电子科技有限公司；沃特浦制水机：四川沃特尔水处理有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

芦丁标准品：中国食品药品检定研究院；其余试剂均为分析纯；茶树枝叶：广东富阳。

2 方法

2.1 茶树枝叶的预处理

称取完全阴干的茶树枝叶5 g，加入60%的乙醇125 mL，50℃水浴浸泡1 h，超声提取40 min，抽滤提取液；重复操作3次，至样品中的色素基本萃取干净。将提取液于55℃旋转蒸发，除尽乙醇，备用。

2.2 茶树总黄酮的含量测定

2.2.1 标准曲线的绘制

总黄酮含量测定方法为经典亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法。本试验以芦丁为标准品，测定茶树总黄酮的含量。称取芦丁标准品11.0 mg，置于100 mL容量瓶中定容，然后分别取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，依次加入60%的乙醇至5 mL，10%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀静置6 min，再加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀静置6 min，再加入8%的氢氧化钠溶液2 mL，最后用60%的乙醇定容至10 mL，摇匀静置15 min，在510 nm波长处测定其吸光度。

2.2.2 样品含量的测定

按照2.1项下的方法超声提取，将所得提取液用60%的乙醇定容至25 mL，再吸取1 mL的提取液置于25 mL容量瓶中，然后按照2.2.1标准曲线的方法对其进行测定。

2.3 单因素试验设计

以60%的乙醇溶液为提取剂，选择影响茶树总黄酮得率的4个因素乙醇溶液浓度、料液比、超声时间及超声温度设计单因素试验。

表1 单因素试验设计Table 1 Single factor test design

2.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果确定响应曲面的优化范围，确定超声温度为70℃。应用Design Expert 8.0.6.1软件，以X1乙醇浓度，X2料液比，X3超声时间为变量，以-1，0，1代表变量低、中、高3个水平，根据Box-Behnken中心组合设计三因素三水平的试验设计，设计方案见表2。

表2 因素水平及编码Table 1 Code and level of factors chosen for the trial

3 结果与数据分析

3.1 芦丁标准曲线

以浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1，得到回归方程：A=12.391C-0.005 9（r=0.999 5）。结果表明，芦丁标准品浓度在0.011 mg/mL～0.055 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

图1 芦丁标准曲线图Fig.1 Rutin standard curve

3.2 单因素试验结果

3.2.1 乙醇浓度对茶树总黄酮得率的影响

乙醇浓度对茶树总黄酮得率的影响结果如图2。

由图2可以看出总黄酮得率随着乙醇浓度的增加先升高后降低，乙醇浓度为60%时达到最高值26.1 mg/g，当乙醇浓度再增大时，总黄酮得率逐渐下降。开始可能是由于乙醇浓度增大，增大了溶质与样品的接触，得率增加；随着乙醇浓度的继续增大，溶剂和溶质的相对极性发生了改变，许多非生物碱类的其他物质也被提取出来，从而影响了总黄酮的得率使其下降。试验表明乙醇浓度不宜过高，所以我们选取60%为乙醇浓度较为合适。

图2 乙醇浓度对茶树总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield

3.2.2 料液比对茶树总黄酮得率的影响

料液比对茶树总黄酮得率的影响见图3。

图3 料液比对茶树总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield

由图3可以看出料液比在1∶30（g/mL）时总黄酮的得率最大。料液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶25（g/mL）范围内，总黄酮的得率增幅较为明显，在1∶25（g/mL）～1∶35（g/mL）时得率增幅减小趋于平稳。说明在一定浓度范围内，增大助溶剂的量对总黄酮的提取有利，当总黄酮的溶出达到平衡后再增大助溶剂的量对总黄酮的提取影响不大，所以我们选取料液比为1∶30（g/mL）最为合适。

3.2.3 提取时间对茶树总黄酮得率的影响

提取时间对茶树总黄酮得率的影响见图4。

由图4可以看出超声时间为40 min时总黄酮的得率最大。超声时间在10 min～40 min范围内总黄酮得率增幅较大，但在40 min～60 min时总黄酮得率趋于平稳。说明提取时间对总黄酮的提取有显著影响，时间过短不利于总黄酮的溶解，时间过长可能引起总黄酮结构的破坏得率下降，综合考虑，提取时间为40 min较为适合。

图4 提取时间对茶树总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield

3.2.4 提取温度对茶树总黄酮得率的影响

提取温度对茶树总黄酮得率的影响见图5。

图5 提取温度对茶树总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction yield

由图5可以看出茶树总黄酮得率随提取温度的升高变化不大，较为平稳，说明提取温度并非是影响茶树总黄酮得率的主要因素。总黄酮得率在70℃时最大，所以选取70℃为提取温度。

3.3 响应面优化茶树总黄酮的提取工艺

3.3.1 响应面试验设计结果

根据Box-Behnken中心组合设计原理，综合单因素试验结果，选取乙醇浓度（X1）、料液比（X2）及超声时间（X3）3个主要考察变量，以茶树总黄酮得率为响应值，进行三因素三水平的响应面分析，研究其对茶树总黄酮得率的影响，试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 响应面法设计与试验结果Table 3 Response surface design and test results

续表3 响应面法设计与试验结果Continue table 3 Response surface design and test results

表4 方差分析结果Table 4 Analysis of variance results

由表3可知，当乙醇体积分数为60%，料液比为1∶30（g/mL），提取时间为40 min时，茶树总黄酮的得率最高为29.7 mg/g。应用Design Expert 8.0.6.1软件对表中的数据进行多元回归拟合，得到茶树总黄酮得率（Y）对各因素变量的二次方程模型为：Y=29.29+0.68X1+1.91X2+0.81X3+1.25X1X2-1.39X1X3-0.47X2X3-3.02X12-1.97X22-2.93X32。对模型进行方差分析，由表4可知，P＜0.005，说明本试验模型具有显著性；失拟项F=9.00＞8.81，失拟项P＜0.001，失拟显著。模型的决定系数Adj R2=0.818 3，模型能解释81.83%的响应值变化，模型确定系数R2=0.920 5，模型拟合度良好，说明用此模型对超声波提取茶树总黄酮的效果进行分析是合理可行的。

3.3.2 响应曲面分析

应用Design Expert 8.0.6.1软件绘制响应面，通过分析响应面的形状来考察3个主要因素对茶树总黄酮得率的影响，响应面图见图6。

图6 两因素交互作用对茶树总黄酮得率影响的响应面图Fig.6 Response surface plots showing the effects of two factors interaction on the extraction rate of total flavonoids from tea tree

通过响应面图6，我们可以直观的看出两因素交互作用对茶树总黄酮得率的影响，其中乙醇浓度和料液比的交互作用较为显著。通过响应面模型求最优组合，得到茶树总黄酮最佳提取工艺参数为乙醇浓度60%，料液比 1∶30（g/mL），提取时间 40 min，总黄酮的得率为29.7 mg/g。

3.4 验证试验

取茶树枝叶5 g，按优化后的条件[乙醇浓度60%，料液比1∶30（g/mL），提取时间40 min]进行茶树总黄酮的提取验证试验，试验重复3次。茶树总黄酮得率的平均值为29.7 mg/g，RSD值为0.07%。说明，最佳提取工艺参数准确可靠，具有较好的稳定性。

4 讨论与结论

本文应用Design Expert 8.0.6.1软件，通过响应面模型，得出茶树总黄酮的最佳提取工艺条件及其两因素之间的交互作用对茶树总黄酮得率的影响。最佳提取工艺参数为乙醇浓度60%，料液比1∶30（g/mL），提取时间40 min，乙醇浓度和料液比交互作用最为显著，茶树总黄酮的平均得率为（29.7±0.07）mg/g，说明该模型较为稳定可靠。

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