响应面法优化刺梨总黄酮提取工艺

刘英，张丽艳，*，罗君，谢宇

（1.贵阳中医学院，贵州贵阳550002；2.贵阳中医学院第一附属医院，贵州贵阳550001；3.贵州广济堂药业有限公司，贵州贵阳550014）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）为蔷薇科植物，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版）[1]，其果实具有消食健脾、收敛止泻的功效，主治积食腹胀、泄泻，也为贵州省苗族习用药材[2]。刺梨主要分布于贵州、四川、湖北、云南等省，其含有丰富的黄酮类、维生素C等[3]。黄酮类化合物是植物经光合作用产生的一类活性物质，具有抗衰老、抗菌、抗炎等功效[4]。刺梨可药食两用，目前在医药和食品等领域被广泛应用，其需求量呈逐年上升趋势[3]。刺梨总黄酮提取工艺的研究虽有报道[5-6]，但主要采用正交试验设计，响应面法是一种试验设计与数学建模相结合的优化方法[7]，克服了正交试验只对孤立的试验点进行分析的缺点，现已广泛用于食品药品有效成分的工艺研究[8-9]。基于此，本研究利用单因素试验结合响应面法优化刺梨总黄酮的提取工艺，以期为提高刺梨的综合利用率，降低生产成本，改进工业生产技术参数提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨：采集于贵州省龙里县谷脚镇茶香村，经贵阳中医学院魏升华教授鉴定为蔷薇科植物缫丝花Rosa roxburghii Tratt.的果实。鲜果去掉种子、萼片，粉碎过四号筛，密封备用。

芦丁对照品（批号：10080-200707）：中国药品生物制品检定所；乙醇：重庆川东化工有限公司；氢氧化钠：广东汕头市西陇化工厂；硝酸铝：天津市科密欧化学试剂有限公司；亚硝酸钠：重庆江川化工有限公司；以上试剂均为分析纯；水：蒸馏水。

1.2 仪器设备

UV-2501PC型紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；AL204型电子天平：梅特勒-托利多公司；电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；GZX-GF101-4-S-II型电热恒温鼓风干燥箱：上海贺德实验设备有限公司；KQ5200DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

取芦丁对照品适量，精密称定，加65%乙醇溶液制成每1 mL含芦丁0.5 mg的溶液，即得。

1.3.2 供试品溶液的制备

取刺梨粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入65%乙醇溶液35 mL，密塞，称定重量，于70℃回流提取115.5 min，放冷，再称定重量，用65%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.3 检测波长的确定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液适量，分别置10 mL量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，加65%乙醇溶液至刻度，摇匀，放置15 min。以试剂空白作参比，在200nm～800 nm波长范围内扫描，结果在499 nm波长处有一最大吸收峰，故选取499 nm为检测波长。

1.3.4 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分别置10 mL量瓶中，照“1.3.3”项下方法，于499 nm波长测定吸光度。

1.3.5 样品中总黄酮的含量测定

精密量取样品溶液适量，置10 mL量瓶中，按照“1.3.3”项下方法，于499 nm波长测定吸光度，根据回归方程求出浓度，再根据式1计算总黄酮提取率：

式中：C为提取总黄酮的浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为提取液体积，mL；W为样品质量，g。

1.3.6 单因素试验考察

1.3.6.1 提取方法

取刺梨粉末（晒干）约0.5 g，精密称定，固定提取溶剂 75%乙醇，料液比 1∶80（g/mL），提取时间 60 min，提取温度70℃，考察不同提取方法（回流法、超声法、冷浸法）对总黄酮提取率的影响。

1.3.6.2 溶剂浓度

取刺梨粉末（晒干）约0.5 g，精密称定，固定提取方法回流法，料液比1∶80（g/mL），提取时间60 min，提取温度70℃，考察不同浓度乙醇（45%、55%、65%、75%、85%、95%、100%）对总黄酮提取率的影响。

1.3.6.3 提取时间

取刺梨粉末（晒干）约0.5 g，精密称定，固定提取方法回流法，提取溶剂提取溶剂65%乙醇，料液比1∶80（g/mL），提取温度 70℃，考察不同提取时间（30、60、90、120、150 min）对总黄酮提取率的影响。

1.3.6.4 料液比

取刺梨粉末（晒干）约0.5 g，精密称定，固定提取方法回流法，提取溶剂提取溶剂65%乙醇，提取时间120 min，提取温度70℃，考察不同料液比[1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70、1 ∶80、1 ∶90（g/mL）]对总黄酮提取率的影响。

1.3.7 响应面试验设计

通过单因素试验结果确定响应面试验设计的因素和水平，选取溶剂浓度（A），料液比（B），提取时间（C）为试验因素。根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，以总黄酮提取率（%）为评价指标，设计三因素三水平响应面法试验，共17个试验点，其中12个析因试验，5个中心试验。试验因素及水平见表1。

表1 因素水平编码Table 1 Coded of factors and levels

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的制作

以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：A=11.847C+0.0314（r=0.999 6），结果表明芦丁在0.01 mg/mL～0.06 mg/mL呈良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取方法对总黄酮提取率的影响

提取方法对总黄酮提取率的影响见图1。

图1 提取方法对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of extraction methods on extraction yield of total flavonoids

由图1可知，回流提取的总黄酮提取率较高，故选择回流法为提取方法。

2.2.2 溶剂浓度对总黄酮提取率的影响

溶剂浓度对总黄酮提取率的影响见图2。

图2 溶剂浓度对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of dissolvant concentration on extraction yield of total flavonoids

由图2可知，随着乙醇浓度的增大，刺梨总黄酮提取率呈先升后降的趋势，当乙醇浓度为65%时，总黄酮提取率较高。原因可能为刺梨中等极性的黄酮类物质含量较高，当乙醇浓度大于65%时，溶剂的极性降低，导致某些黄酮类物质的溶解度下降，而脂溶性物质溶出量增大，故选择65%乙醇为提取溶剂。

2.2.3 提取时间对总黄酮提取率的影响

提取时间对总黄酮提取率的影响见图3。

由图3可知，当提取时间小于120 min时，随提取时间的增加，总黄酮提取率逐渐增大，120 min后，总黄酮提取率呈下降趋势，原因可能为随着提取时间的延长，总黄酮的结构被破坏或其稳定性变差，故选择120 min为提取时间。

图3 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.2.4 料液比对总黄酮提取率的影响

料液比对总黄酮提取率的影响见图4。

图4 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由图4可知，随溶剂体积的增加，总黄酮提取率逐渐增大，料液比达1∶70（g/mL）后，总黄酮提取率呈下降趋势，原因可能为随着溶剂体积的增大，一些非黄酮类可溶性物质的溶解度也逐渐增大，导致总黄酮提取率降低，故选择1∶70（g/mL）为料液比。

2.3 响应面法优化结果及分析

2.3.1 响应面试验方案及结果见表2。

表2 响应面分析方案及结果Table 2 Experiment design and result of response surface method analysis

续表2 响应面分析方案及结果Continue table 2 Experiment design and result of response surface method analysis

2.3.2 模型的建立及其有效性检验

为了明确各因素对总黄酮提取率的影响，以总黄酮提取率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6对试验数据进行多元回归拟合，得到总黄酮提取率与各试验因素的多元二次回归方程模型Y=10.68+0.010A-0.13B+0.22C-0.16AB-0.17AC-0.099BC-0.79A2-0.49B2-0.85C2，方程中各项系数绝对值的大小反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。为了检验该模型的有效性，对该二次模型及其回归系数进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation

由表3可知，该模型P＜0.000 1，说明该模型是极显著的；该模型的失拟项P=0.446 0＞0.05，且该模型的复相关系数R2=0.986 4，说明总黄酮提取率的变化有98.64%来源于试验因素，1.36%的数据失拟可能由随机误差引起，该模型与实际情况拟合较好，失拟项不显著，可用于预测刺梨总黄酮提取率并对刺梨中总黄酮的提取工艺进行优化。在本试验设定的区域范围内，提取时间的线性效应、溶剂浓度和提取时间的交互作用、溶剂浓度和料液比的交互作用对刺梨总黄酮提取率有显著影响；料液比的线性效应、溶剂浓度的曲面效应、提取时间的曲面效应、料液比的曲面效应对刺梨总黄酮提取率有极显著影响；表明各因素对总黄酮提取率的影响不是简单的线性关系。因素系数的F值越大则表明该因素对响应值的影响越大，故影响总黄酮提取率的因素主次顺序为：C>B>A，即料液比＞提取时间＞溶剂浓度。

根据回归方程绘制出响应面图和等高线图，通过响应曲面图的陡峭程度及等高线图形状可分析当溶剂浓度，提取时间，料液比其中一个因素固定时，另外两个因素对总黄酮提取率的影响，结果见图5～图7。

图5 溶剂浓度与提取时间对总黄酮提取率的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface polt and contour for the effects of dissolvant concentration and extraction time on extraction yield of total flavonoids

从响应曲面的陡峭程度可以看出，料液比和提取时间对总黄酮提取率的影响较显著，表现为曲线较陡，溶剂浓度对总黄酮提取率的影响较小，表现为曲线较平滑，这与方差分析所得的结论一致。

等高线的形状可以反映两因素交互作用的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著。由各因素交互作用的等高线可知溶剂浓度与料液比的交互作用较显著，溶剂浓度与提取时间交互作用次之，料液比和提取时间的交互作用较小，这与方差分析结果相符。

图6 溶剂浓度与料液比对总黄酮提取率的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface polt and contour for the effects of dissolvant concentration and material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.3.3 验证试验

本试验以总黄酮提取率为指标，通过Design-Expert 8.0.6软件分析，得到总黄酮的最佳提取条件为：溶剂浓度为65.06%，提取时间为115.49 min，料液比为1∶71.37（g/mL）。此条件下，总黄酮提取率的理论预测值为10.71%。为了验证响应面法所得结果的可靠性，采用优化所得的提取工艺进行提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为：65%乙醇为提取溶剂，提取时间为 115.5 min，料液比为 1∶71（g/mL），在此条件下进行6组重复试验，所得总黄酮平均提取率为10.76%，与理论预测值的相对偏差为0.32%，说明此模型准确可靠，可用于预测不同提取条件下总黄酮的提取率。

3 结论

本研究通过单因素试验分别考察了提取方法、溶剂浓度、提取时间、料液比对刺梨中总黄酮提取率的影响，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，依据单因素试验的结果选取溶剂浓度，提取时间，料液比为考察因素，设计三因素三水平响应面法试验，最终得到的刺梨提取工艺为：65%乙醇为提取溶剂，提取时间为 115.5 min，料液比为 1∶71（g/mL），在此条件下总黄酮的提取率为10.76%。响应面法优化所得的总黄酮提取工艺准确可靠，具有一定的实用价值。

图7 提取时间与料液比对总黄酮提取率的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface polt and contour for the effects of extraction time and material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

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