InDel分子标记及其在水稻研究中的应用

刘 丹，孙玉友，魏才强，解 忠，李洪亮，张巍巍，程杜娟，孙国宏，徐德海

（黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江157041）

近年来，随着分子生物学的快速发展，以分子标记育种、转基因育种和分子设计育种为代表的现代作物分子育种技术逐渐成为了全世界作物育种的主流［1］。水稻是我国最重要的粮食作物之一，目前，许多分子标记技术已广泛地应用于水稻的遗传育种研究中，如随机扩增多态性（RAPD）［23］、简单重复序列（SSR）［45］、扩增片段长度多态性（AFLP）［67］以及单核苷酸多态性（SNP）［810］等。InDel分子标记是一种新型的分子标记，它是指根据在不同个体间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失（insertiondeletion）而设计的多态性引物。研究发现，InDel在水稻基因组中分布广泛，Shen等［11］将日本晴和9311全基因组序列进行比对，发现每953 bp就有1个InDel。Feltus等［12］通过日本晴和9311序列的Blast比对，认为InDel在基因组中分布不均匀，在基因克隆过程中，除利用现有的多态性In Del标记外，还应该在定位的染色体区间寻找和开发新的InDel标记。由于InDel分子标记具有密度大、准确性高、重演性好以及易操作等特点，目前已广泛应用于水稻遗传分析和分子辅助育种中。本研究对In Del分子标记的开发特点及其在水稻籼粳分化、遗传多样性分析、基因定位以及功能标记开发等方面的研究应用进展进行了综述，旨在为今后开展水稻分子育种研究中更好地利用InDel分子标记提供参考。

1 InDel分子标记的开发和特点

InDel是指同源序列比对产生碱基的插入／缺失现象。通过对In Del位点序列分析，通常可以将In Del分成几种类型，即单碱基插入／缺失、单碱基对插入／缺失、2～15 bp小重复单元的多碱基对插入／缺失、转座子插入以及随机DNA序列插入／缺失［13］。Britten等研究发现，InDel长度变化很大，变化范围在1～10 000 bp内，平均长度为36 bp，但99%以上的InDel长度小于50 bp［14］。InDel分子标记的开发是基于已知的基因（DNA）序列，通过利用Blast比对明确不同品种个体之间序列的差异，筛选出存在插入／缺失的序列位点，再根据这些位点两端的序列设计引物来扩增这些发生插入／缺失序列区间（图1）。初志战等［15］通过比对粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，在全基因组范围内设计了634对In Del候选标记，通过检测粳稻和籼稻的多态性，最终开发了295对标记可以用于籼粳亚种的基因定位和分子育种中。

InDel标记是以PCR扩增技术为基础，其本质上依旧是属于碱基序列长度多态性标记。大量研究表明，In Del标记具有开发成本低，重演性好，结果准确，亚种间多态性高，分型简单以及操作简单易行等优点［1618］，目前，已经广泛应用于籼粳属性鉴定、群体遗传分析和分子辅助育种等领域。

图1 InDel分子标记多态性

2 InDel分子标记在水稻籼粳分化和品种资源鉴定上的应用

2.1 InDel分子标记能高效鉴定水稻籼粳分化水平

籼稻和粳稻是亚洲栽培稻主要的2个亚种，是栽培稻在长期栽培和驯化中经自然选择和人工选择逐渐分化而成。大量研究发现，籼稻和粳稻遗传差异明显，其农艺性状和生理生化特性等方面存在着显著的差异，利用籼粳稻亚种间杂交产生的F1代杂种优势明显，比亚种内杂交具有更强大的杂种优势［1922］。因此，准确高效鉴定水稻材料的籼粳属性对于开展水稻籼粳亚种间杂种优势利用有着重要意义。

目前，“程氏指数法”是对籼稻和粳稻进行鉴定的最常用方法，但由于它是基于水稻形态变异和生理生化指标进行综合打分判定，易受环境和操作者经验影响［2324］。此外，近年来研究者发现一些分子标记，如RAPD，RFLP以及SSR等也能对籼稻和粳稻进行快速鉴定［2528］，但由于这些分子标记其本身不是籼粳特异性分子标记，因此很难系统、准确和全面地对籼稻和粳稻进行快速的鉴定。随着粳稻日本晴和籼稻9311的全基因组测序完成，利用全基因组序列比对挖掘插入／缺少标记为水稻籼粳属性的快速精确判定提供了新的捷径。卢宝荣等［29］利用45个In Del引物对44份典型籼稻和典型粳稻品种进行了实验验证分析，筛选出34个InDel特异性引物，并针对水稻籼粳属性进行判定提出了“InDel分子指数法”。蔡星星等［30］研究证实了InDel标记法完全可以用于栽培稻的籼粳属性鉴定及籼粳分化问题研究。王礼友等［31］采用优化后的In Del引物对48份常用的籼稻、粳稻和中间型材料进行了籼粳筛选鉴定，并通过比对程氏指数法的结果检验了In Del分子标记法在水稻籼粳属性鉴定上的有效性。陈萍萍等［32］利用InDel标记鉴定了9份水稻籼粳交衍生品系的籼粳属性，并将它们分别划分为籼稻类型，偏籼类型和偏粳类型3种类型。姚国新等［33］利用InDel标记量化中国栽培水稻微核心种质的籼粳成分。结果表明，微核心种质中典型籼稻、籼稻、偏籼、中间型、偏粳、粳稻和典型粳稻的比例分别为53.26%、9.24%、1.63%、1.09%、3.26%、9.78% 和 21.74%，偏籼粳中间型的材料较少。桂君梅等［34］选用了18对InDel分子标记引物，检测了24个籼粳杂交组合和粳粳杂交组合的水稻样品在InDel位点上的粳型基因频率。结果表明，18对InDel引物均可扩增获得每个材料的籼稻特异带、粳稻特异带和籼粳杂合带型，并通过计算粳型基因型频率，能够准确地判别出参试材料籼粳属性，鉴别参试品种的类型。

2.2 In Del分子标记在水稻品种资源鉴定上的应用

水稻品种的鉴定其本质都是品种的基因型鉴定。目前，DNA分子标记技术在水稻品种鉴定和DNA指纹图谱的构建中已经得到了广泛的应用，尤其是SSR分子标记［3537］，ISSR 分 子 标 记［38］和 RAPD 分 子 标 记等［39］。In Del作为一种新开发的分子标记也为作物品种鉴定提供了新的思路。目前，In Del分子标记已经广泛应用于玉米杂交种［40］、白菜杂交种［41］以及黄瓜［42］等农作物的品种鉴定中，但有关水稻品种资源鉴定的报道极为少见。冯芳君［43］研究了SSR和In Del标记在水稻籼粳亚种分化与杂种纯度鉴定中的应用，发现了17个标记具有亚种间完全专化性，并筛选到1个SSR标记可用于杂交旱稻新品种旱优2号种子纯度的快速鉴定。In Del分子标记具有亚种间特异性，其种间专化性较强，在进行水稻品种鉴定时，主要是进行水稻种质资源的籼粳属性鉴定和分析，而在种内鉴定过程中，由于In Del的多态性水平低于SSR，所以涉及水稻品种资源鉴定和DNA指纹图谱构建过程的相关研究报道较少。

图2 DEP 1基因等位变异及其分子标记多态性检测

表1 水稻中部分已开发的InDel功能基因标记

3 InDel分子标记在水稻遗传多样性和遗传组成分析上的应用

至今为止，利用InDel分子标记分析水稻的遗传多样性，前人已有相关报道。Shen等［11］利用日本晴和9311基因组序列比对构建了包含479 406个InDel多态性的水稻数据库，为开展水稻遗传多样性分析奠定了基础。冯芳君等［17，43］对水稻InDel和SSR标记多态性进行了比较分析，通过对46个InDel标记和53个SSR标记在93个水稻品种中的多态性比较，认为InDel标记具有数量多，扩增产物稳定和易于检测等优点。进一步分析发现，利用程氏指数，InDels和SSR标记的聚类结果基本一致。In Del分子标记在籼粳亚种间具有很高的多态性，但亚种内多态性较低，平均多态性水平显著小于SSR标记。刘丹等［44］利用34对InDel分子标记和54对ILP分子标记一起分析了东北地区杂草稻与栽培稻遗传多样性及籼粳分化，结果表明，参试标记能够高效地鉴别稻属资源的籼粳属性，共检测到156个等位基因，平均有效等位基因（Na）为1.773，且东北地区杂草稻多样性水平略高于当地栽培稻。此外，在对品种的遗传组成分析上，杨贤莉等［45］利用籼粳特异性的In Del标记分析了570份参试品系的籼稻血缘含量，结果表明，54.0%的参试材料在32个位点上有一定籼型血缘引入，且第5染色体上存在的籼型位点较多，占该染色体的20.8%。刘丹等［46］利用In Del和SSILP标记分析北方粳型超级稻的遗传组成，结果表明，参试粳型超级稻品种均含有一定的籼型血缘，且不同地区和不同年代育成品种籼稻血缘存在差异。由此可见，InDel分子标记能够有效地鉴定水稻的遗传多样性水平和遗传组成，开发和利用In Del分子标记对于深入揭示水稻遗传基础具有重要指导意义。

4 InDel分子标记在水稻基因定位上的应用

在进行水稻基因图位克隆的过程中，亲本选择一般都存在籼稻与粳稻差异，因此可以结合亲本测序或者是根据籼稻9311和粳稻日本晴的全基因组序列比对差异，设计InDel引物，从而实现染色体标记加密，实现精细定位和克隆的目的。闫双勇等［47］研究表明，In Del标记的多态性比SSR标记小，且带型简单，分布较密，非常适合于构建高密度遗传连锁图谱和基因定位研究。Ma等［48］和 Schnabel等［49］研究也认为，InDel分子标记在染色体步移和基因精细定位等多个方面研究都呈现出广泛的应用前景。

王会民［50］利用34个InDel和87个SSR标记构建了染色体片段代换系，并在第7号染色体上定位到了1个控制根长的主效QTL位点qRL7，位于SSR标记RM 3859与RM 214之间。在进行精细定位的过程中，利用2个亲本协青早B和R 9308的测序信息，截取RM 3859和RM 214标记区间两段DNA序列进行比对，从而在此区间内设计出了42对In Del引物，并筛选到9对具有多态性引物，最终将qRL7定位在Indel11与Indel17之间。Chen等［51］利用半矮秆突变体材料与粳稻构建定位群体，并利用SSR标记将1个控制水稻株高和分蘖性状的隐性等位基因sdc初定位在12号染色体RM 27877和RM 277之间，然后在该区间进一步开发了39个InDel分子标记，最终将sdc基因定位在InDel标记C 11和C 12之间，距离着丝粒1 c M的距离。王军等［52］对1个白化转绿自然突变体进行了定位研究，遗传分析表明，该突变体叶色性状受1对隐性核基因控制，利用SSR分子标记将V13（t）初步定位在水稻第5染色体上的RM 3638与RM 459标记之间，其遗传距离分别为3.2 c M和0.5 c M。进一步利用已公布的SSR标记和新发展的InDel标记将V13（t）定位在InDel 511与InDel 58之间的98.9 kb范围内，同时获得1个与V13（t）共分离的标记In Del 52。邵元健等［53］对1个水稻不完全隐性卷叶主基因rl（t）进行了定位研究。利用BC4F2分离群体将rl（t）初步定位于第2染色体长臂位于标记InDel 112～RM 3763之间遗传距离为2.4 c M的区域，其中距离InDel 112约1.0 c M。进一步从BC4F2代经标记选择得到1个中度卷叶植株，并构建BC4F3代株系，另发展4个新的In Del标记，最终将rl（t）精细定位于InDel 112.6～In Del 113之间，物理距离为137 kb。

5 In Del功能基因分子标记的开发与应用

功能性分子标记是建立在关联分析或近等基因系中等位基因的功能性基序中单核苷酸多态性位点基础上的一类新型显性分子标记，利用该标记可大大提高分子标记辅助选择的效率。郑天清等［54］通过全球3 000份水稻资源的全基因组重测序，获取了其中质量较好的2 859份水稻基因组的单核苷酸多态性（SNP）及小片段插入缺失（In Del）的基因组变异数据，建立了综合性的水稻功能基因组育种数据库的SNP与In Del多态性子数据库，为研究水稻基因功能、指导水稻全基因组选择育种提供重要平台。同时，在开展水稻分子标记辅助选择育种（MAS）过程中，往往也会根据前人已有的研究成果，针对控制某一特定性状的已克隆的基因开发功能性In Del标记，通过电泳检测，从而达到快速鉴定育种材料的目的。诸如控制水稻粒型的基因qSW5、GS5和qGW8，控制穗粒数的Gn1a基因，控制直立穗型的DEP1基因以及控制氮高效利用的NRT1.1B基因等（表1）。Duan等［65］通过 GWAS分析，在qSW5／GW5区域鉴定了一个新的控制粒型性状的调控基因GSE5。研究表明，GSE5缺失籽粒变宽，粒重增加，过表达该基因籽粒粒型变窄。GSE5基因在栽培稻的启动子区域存在3个单体型（GSE5，GSE5DEL1＋IN1和GSE5DEL2），其中籼稻品种缺失950 bp碱基携带了GSE5DEL1＋IN1单体型，粳稻品种缺失1 212 bp碱基携带了GSE5DEL2单体型，它们都减少了GSE5的表达，从而导致籽粒变宽。由此，可以开发出新的InDel功能标记，对水稻品种的GSE5位点进行快速检测，从而有效鉴定籽粒的大小。

DEP1基因是一个控制水稻穗型的基因，目前已在我国水稻增产中发挥了关键作用。研究表明，它能促进细胞分裂，降低穗颈节长度，从而使得稻穗变密、枝梗数增加、每穗籽粒数增多，最终实现水稻增产15%～20%［66］。Huang等［66］研究表明，DEP1基因是由于获得性突变造成的，突变体DEP1的等位基因dep1中有637 bp的碱基序列被12 bp的序列所代替，导致编码提前终止，从而与前者编码的蛋白不同。根据DEP1基因的序列，我们设计了InDel功能性分子标记，其序列为 F：5’AAAGACCAAGGTGCCTCA3’，R：5’TGGTTCAACCTCGTCTCATA3’，扩 增产物片段长度为466／1 091 bp，可以快速有效地对水稻品种的DEP1基因位点进行鉴定，开展直立穗型育种和新直立穗基因位点的挖掘。由图2可知，参试36份黑龙江粳稻材料中，松粳3和松粳5扩增片段大小为466 bp，为直立穗型品种，而牡丹江30等其它34份材料扩增片段大小为1 091 bp，为弯穗型品种。由此可见，利用该InDel功能性分子标记，能够快速准确地鉴定水稻的穗型类别，为开展MAS育种奠定了基础。

6 总结与展望

DNA高通量测序技术的快速发展，为水稻全基因组研究提供了前所未有的机遇。通过全基因组序列比对，挖掘出基因组碱基序列的插入／缺失形成了DNA片段长度的多态性，并开发出了In Del分子标记。目前，InDel分子标记已经广泛应用于水稻遗传育种研究中，通过对前人的研究工作进行总结，不难发现其涉及的领域主要有以下3个方面：1）利用InDel分子标记能够在分子层面上准确地分析水稻品种的籼粳基因型频率、籼粳属性以及品种类型等，这对开展水稻籼粳杂交育种充分发挥杂种优势具有重要指导意义。2）利用In Del分子标记能够加密遗传图谱，进行重要农艺性状的基因定位和图位克隆，为水稻重要农艺性状调控机理的阐述提供了“元件”。3）根据已经克隆的控制水稻重要农艺性状的功能基因开发设计In Del功能基因标记，能够快速鉴定育种材料的基因型和等位基因变异情况，为开展功能基因标记辅助选择育种奠定了基础。随着DNA分子标记技术和测序技术的不断完善和改进，相信越来越多的功能基因将会被克隆和测序，它们将为开展现代水稻分子育种工作奠定基础。可以预见，今后在水稻的遗传育种研究中，InDel分子标记将具有极其广阔的应用前景和利用价值。

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