根皮苷氧化物POP2的酶促反应体系及其结构表征

王娟，邓红，刘芸，郭玉蓉，孟永宏

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710119）

0 引言

【研究意义】苹果中含有维生素、矿物质、糖类、酸类、果胶以及苹果多酚、类黄酮等多种物质[1]，具有生津、润肺、开胃、止泻、通便功效[2]。苹果中类黄酮的含量随着品种和种植地的不同而有所差异，其含量约为114—803 μg·g-1[3]，是天然的优质抗氧化剂。然而，在苹果汁和苹果酒的加工过程中，随着植物细胞组织结构的破坏，释放出的多酚氧化酶（PPO）在氧气（O2）的参与下产生酶促反应，生成许多新的多酚氧化物，是造成果汁褐变和劣变[4]的主要原因之一。多酚氧化酶是一种含铜离子的金属蛋白体[5]，它的催化作用分为两种[6]：一种是选择性地催化酚羟基化生成邻二酚，邻二酚产物继续被氧化生成邻苯醌；另一种是先在多酚氧化酶的作用下形成不稳定的邻苯醌类化合物，然后再进一步通过非酶氧化反应聚合生成黑色素[7]，如儿茶素类多酚在多酚氧化酶与氧气作用下生成邻苯醌类，邻苯醌类化合物再进一步生成茶黄素或茶红素类物质。多酚氧化酶可作用于一元酚、邻苯二酚和对苯二酚等底物，科学研究中经常利用与邻苯二酚的反应测定多酚氧化酶活性强度[8]。酶促褐变后的果汁中含有大量的多酚氧化产物，在传统果汁加工过程中经过脱色树脂进行吸附去除[9]，以便维持果汁的色值、储藏稳定性。但是，长久以来，人们并没有重视和研究生产中大量产生的苹果多酚氧化产物，其对果汁褐变、劣变的影响和生物功能尚不清楚。【前人研究进展】目前国内外主要是通过研究不同苹果多酚对多酚氧化酶催化特性的影响，为工业生产苹果汁减少酶促褐变提高色值提供理论依据[10]。苹果中的多酚物质主要为黄酮醇类物质（槲皮苷、芦丁），黄烷醇类物质（原花青素、儿茶素类），二氢查耳酮类（根皮苷、根皮素），羟基肉桂酸（绿原酸）等[11]。宋烨等[12]通过高效液相色谱法测定分析了不同苹果品种中多酚的组成及果实的褐变度，结果显示，果实的褐变度与根皮苷、儿茶素、原花青素的相关性较高，绿原酸与果实褐变度相关性较低。OSZMIANSKI等[13]通过添加不同浓度的绿原酸和儿茶素研究根皮苷的酶促氧化速率，进而根据褐变值判断同一反应体系中绿原酸和儿茶素对根皮苷氧化物积累的促进作用，但是有关苹果多酚褐变的反应历程尚不清楚。【本研究切入点】目前国内外通过模拟苹果多酚体外氧化试验对果汁工业加工减少酶促褐变提供理论依据，但并未对其褐变产物加以分析鉴定，无法评价多酚氧化物对苹果汁褐变的影响。【拟解决的关键问题】通过多酚氧化酶氧化根皮苷反应体系的建立，分离纯化POP2，对其结构进行表征分析，明确苹果汁酶促氧化反应中的主要氧化物，以及根皮苷氧化物生成的条件与反应历程，以苹果多酚氧化物的含量高低为标志，为建立苹果汁褐变和劣变的检测指标提供参考。

1 材料与方法

试验于2016年11月至2017年5月在陕西师范大学长安校区食品学院进行。

1.1 材料与试剂

根皮苷（C12H24O10）由西安天美生物科技股份有限公司提供，纯度为 95%；多酚氧化酶 Polyphenol Oxidase（PPO），1 800 U·mg-1，美国 Worthington 公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），美国 Fisher公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、乙酸乙酯均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Thermo高效液相色谱仪，美国热电公司；高分辨液质联用 LC-MS，德国 Bruker；红外光谱仪，德国Bruker；真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pH、温度、底物浓度对 PPO酶促氧化的影响选取磷酸盐缓冲液pH梯度[14]为：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，室温下用不同pH的磷酸盐缓冲液分别配制3 mg·mL-1根皮苷反应液29 mL，将配制好的反应液置于35℃磁力搅拌器中，加入1 mL（900 U）PPO。

底物浓度梯度为：0.5、1.0、3.0和 5.0 mg·mL-1，用pH为6.5的磷酸盐缓冲液分别配制根皮苷反应液29 mL，置于35℃磁力搅拌器中，加入1 mL（900 U）PPO。

反应温度梯度[15-16]为：25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，用pH为6.5的磷酸盐缓冲液分别配制3 mg·mL-1根皮苷反应液29 mL，分别置于不同温度的磁力搅拌器中，加入1 mL（900 U）PPO。在研究pH和底物浓度对PPO酶促氧化的影响时，测定方法为每隔20 min移取反应液 0.5 mL，迅速置于 80℃水浴锅中灭酶5 min，稀释10倍后置于比色皿中，连续测定120 min内（每隔20 min测一次）反应液在420 nm 处的吸光度值。在研究温度对PPO酶促氧化的影响时，设定反应时间120 min，反应完成后迅速灭酶，并稀释10倍后测定吸光度。

以吸光度An为纵坐标，各影响因素为横坐标，研究不同pH、温度、底物浓度对PPO酶促氧化的影响。1.3.2 无水乙醇对 PPO酶促氧化的影响 室温下选取1.3.1中最佳反应速度的磷酸盐缓冲液的pH、温度、底物浓度配制无水乙醇含量分别为 0、10%、20%、30%、40%、50%的根皮苷反应液，其他反应条件及测定方法同1.3.1。

1.3.3 酶促反应历程 室温下在pH 6.5的磷酸盐缓冲液中加入 20%的无水乙醇配制根皮苷反应液 3 mg·mL-149 mL，置于35℃磁力搅拌器中，加入1 mL（1 500 U）PPO，分别在反应进行的0、1、2、4、10、24和48 h取样1 mL，并迅速储存于-20℃冰箱终止酶促反应，用于高效液相色谱法（HPLC）在280 nm和420 nm处检测根皮苷的减少量及氧化物的生成量。

1.3.4 根皮苷氧化物的纯化 预试验得到根皮苷氧化物为水溶性产物，而根皮苷易溶于乙酸乙酯，所以将反应完成的反应液用两倍体积的乙酸乙酯溶液萃取3次以除去未反应的根皮苷，萃取后的反应液经真空冷冻干燥后用超纯水溶解至饱和状态，加入无水乙醇进行脱盐处理，再经旋转蒸发仪减压蒸馏除去乙醇，经80%甲醇重结晶后得到氧化产物纯品[17]。

1.3.5 高效液相色谱法 将1.3.4中的样品从冰箱取出溶解后用0.22 μm滤器过滤；进样量：5 μL；色谱柱：C18柱（Diamonsil SB-C18 column，4.6 mm×250 mm）；流动相A为pH 2.6的乙酸水溶液，B为乙腈，流速梯度：0—5 min为 3%—9% B，5—15 min为9%—16% B，15—30 min为16%—30% B，30—45 min为30%—5% B；流速为0.6 mL·min-1；柱温30℃；检测波长为280 nm和420 nm。

1.3.6 质谱（ESI-MS）分析氧化物 质谱条件：电喷雾离子源；喷雾电压：0.4 bar；正离子模式；质量扫描范围m/z 100—1 000；母离子m/z 467。

1.3.7 红外光谱（IR）分析氧化物 溴化钾提前在90℃烘箱中烘干24 h备用，取约2 mg样品与烘干的溴化钾充分混合并研磨，再转入压片机中使其分布均匀，在抽真空状态下将其压成透明薄片。扫描红外光谱时以溴化钾空白压片作为参比，在4 000—400 cm-1范围内记录其光谱图。

1.4 数据分析

试验数据采用Origin 8.0和Microsoft Excel软件分析处理。采用DPS软件进行显著性分析。

2 结果

2.1 pH、温度、底物浓度对PPO的酶促氧化反应

pH作为影响酶促氧化速率的一个重要因素，由图1-A可以看到，随着pH逐渐从弱酸性（pH 5.5）提高至弱碱性（pH 7.5）时，反应速率也呈现先增后减趋势，在前60 min内，6种pH下的吸光度值都急剧升高，pH 6.5上升的最快，与其他5种具有显著性差异（P＜0.05）。在60—120 min，反应逐渐趋于平缓，并且当反应液处于弱酸性和弱碱性时都不利于酶促反应的进行，其原因可能是当pH接近中性时对多酚氧化酶的铜离子辅基具有稳定作用，pH过高或过低时都会不同程度的导致酶失活。所以选择pH 6.5为根皮苷酶促氧化的最佳pH。

图1-B结果显示，当底物浓度为0.5—3 mg·mL-1范围内，PPO酶促氧化反应随着底物浓度的增加，褐变值也有所上升，当浓度达到 5 mg·mL-1时，反应速度不及 3 mg·mL-1，原因可能是因为底物含量过高对PPO酶活力产生抑制，所以最佳反应底物浓度为 3 mg·mL-1，与其他3组具有显著性差异（P＜0.05）。

温度是果汁加工中一个关键控制点，经常会采用低温控制褐变。图1-C结果显示，在相同的反应时间内，温度较低时，酶促反应很慢；而在35℃时，与其他温度具有显著性差异（P＜0.05），褐变值显示最高；随后温度升高时，褐变值降低，其原因可能是随着温度升高多酚氧化酶变性失活，为了使根皮苷完全转化为氧化物，酶促氧化的温度选择35℃。

图1 pH、温度、底物浓度对POP2转化率的影响Fig. 1 Effects of different pH, temperatures, concentrations on conversion rate ofPOP2

2.2 无水乙醇浓度对PPO的酶促氧化反应

根皮苷在水中的溶解度较小，易溶于无水乙醇等有机溶剂，通过添加不同浓度的无水乙醇对酶促氧化的影响如图2所示，添加不同浓度的无水乙醇均可以提高 POP2的转化率，20%的无水乙醇作用效果最明显，与其他4组具有显著性差异（P＜0.05），乙醇浓度提高至40%时对PPO酶活力产生抑制，可能是因为乙醇是一种具有还原性的一元醇，将 PPO中的 Cu2+还原为砖红色Cu2O沉淀，导致PPO失活。所以最佳的乙醇添加量为20%。

2.3 酶促反应历程

图2 乙醇浓度对酶促反应的影响Fig. 2 Effects of different ethanol concentrations on enzymatic reaction

根皮苷反应液随时间的变化颜色也发生改变，反应刚开始溶液颜色呈微黄色，随着反应的进行颜色逐渐从亮黄色变为橙黄色，最终产物的颜色为橙红色。高效液相色谱检测结果如图3显示，反应过程中有4种物质的含量发生变化，分别是根皮苷、中间产物X1、POP1和POP2，从色谱图中可以看出，0—5 h内，根皮苷的含量急剧减少，在280 nm处检测到中间产物X1和POP1的生成，在420 nm处检测到POP2的生成，在10 h以后，根皮苷的消耗基本不再发生变化，此时根皮苷的转化率已达到 90.2%，中间产物 X1和POP1也基本接近痕量，而POP2含量一直在增加，根皮苷属于一元酚，所以其反应历程（图 4）可能为根皮苷先转化为中间产物X1，X1再迅速转变为中间产物POP1，随后转变为POP2是一个非常缓慢的过程。HPLC结果显示，根皮苷经酶促氧化后，氧化产物的主要成分是POP2，无其他副产物的生成。

图3 反应历程中根皮苷的消耗和POP2的生成Fig. 3 Consumption of phloridzin and the formation of POP2 during 48h reaction

图4 根皮苷氧化物POP2的形成过程Fig. 4 Reaction pathway for formation of phloridzin oxide POP2

2.4 根皮苷氧化物的纯化

根皮苷反应液经PPO酶促氧化48 h后的反应液用两倍体积的乙酸乙酯萃取3次，得到POP2的纯度为96.8%。图5结果显示，HPLC法在280 nm处检测到萃取后反应液根皮苷的峰消失，在420 nm处反应液中仅存在氧化产物 POP2。由于此产物是水溶性化合物，用无水乙醇脱盐后，用80%的甲醇重结晶，得到的结晶物即为根皮苷氧化产物纯品，将其进行质谱和红外光谱分析。

2.5 ESI-MS图

将 2.4中所得到的根皮苷氧化物的结晶纯品用超纯水溶解后再用色谱甲醇稀释至10-6μg·L-1，图6显示，在正离子模式下分析得到根皮苷氧化物m/z为467，即其分子质量应为 466，与所推测的最终产物 POP2相吻合，其分子式为C21H22O12。

图5 萃取过程中根皮苷与POP2的含量变化Fig. 5 Content change of phloridzin (280 nm) and POP2 (420 nm) before and after extraction

图6 根皮苷氧化物POP2的质谱图Fig. 6 Mass spectrogram of phloridzin oxide POP2

2.6 红外光谱图

根皮苷氧化物的红外光谱图（图7）结果显示，1 725 cm-1为酮基（υC=O1 725—1 700 cm-1）的特征吸收峰，1 060 cm-1为饱和脂肪醚（1 150—1 060 cm-1）的特征吸收峰，3 535 cm-1为羟基（υ-OH3 750—3 000 cm-1）的特征吸收峰，1 628 cm-1为苯环的特征吸收峰（1 500—1 700 cm-1），691为苯环上取代基的吸收峰，2 830 cm-1为饱和-CH2（υC-H2 830—2 870 cm-1）的吸收峰，3 271 cm-1为羧酸上的-OH（υO-H3 300—2 500 cm-1）的特征吸收峰，由此推测，与根皮苷氧化物POP2的结构式吻合。

图7 根皮苷氧化物POP2的红外光谱图Fig. 7 Infrared spectrogram of phloridzin oxide POP2

3 讨论

3.1 无水乙醇提高POP2的转化率

苹果中含有一些天然香精[18-19]，在果汁加工中通过回流浓缩收集挥发性物质得到的产品[20]，主要分为醇香型和酯香型两种，马永昆等[21]研究发现苹果中 3种天然香精（SH1、SH2和 SB）中醇类所占比例分别为46.71%、47.01%、24.48%，苹果中各香精成分随着苹果品种和成熟度的不同而有所差异[22]。KLIBANOV[23]和 MA[24]等研究了在有机溶剂中提高酶的活性，相比在水为溶剂的酶促反应中，酶表现出更好的稳定性。郭盼等[25]研究了非水介质中漆酶催化多酚化合物的影响，结果表明低浓度亲水性的有机溶剂甲醇可以促进酶促反应。

果蔬的酶促褐变主要是由于果蔬中富含的 PPO催化酚类物质的氧化反应所引起。PPO可催化果蔬中酚类物质形成醌，醌类物质在果蔬体内进行自身缩合或与细胞内蛋白质反应生成黑色素[26]。在完整的果蔬体内，PPO处于潜伏状态并不起催化作用，但是果蔬在加工过程中组织被损伤，氧气的侵入使多酚氧化酶被激活，作用于酚类物质生成黑色素。所以体外模拟PPO酶促反应时必须具备的条件有：氧气、多酚氧化酶、底物与酶的结合[27]。

果汁中香精为有机溶剂会增加多酚的溶解度，所以为了模拟果汁工业生产体系，在研究pH、底物浓度和温度对PPO酶促氧化影响的基础上，又研究了不同浓度的无水乙醇对PPO酶促氧化的影响，发现20%的乙醇浓度酶促氧化效果最佳，可提高反应转化率 2.4倍，其可能的原因是无水乙醇能使根皮苷充分溶解，使PPO与底物充分结合，有研究表明在酶促氧化过程中乙醇是一种激活剂[28]，但是随着乙醇浓度的升高，酶活力受到抑制，是因为乙醇是一种具有还原性的一元醇，将PPO中的Cu2+还原为砖红色Cu2O沉淀，导致PPO失活。

在果汁生产过程中，可以从隔绝氧气、灭酶、减少底物与酶的结合、除去香精4个方面减少酶促褐变。例如在果汁生产中尽量减少破碎后的苹果与空气接触，采用冷破碎的方式去除苹果皮和苹果籽，防止温度过高发生酶促褐变，杀菌时采用高温短时灭菌或其他非热杀菌技术。通过在根皮苷反应体系中添加不同浓度的乙醇均可促进酶促反应，因此，在工业生产中可先回收苹果香精再进行果汁生产，最后根据需要再将香精添加至果汁中。

3.2 POP2的生成过程

根皮苷在前5 h内消耗的最快，转化率已经达到86.1%，之后根皮苷的含量基本不再发生变化，5 h以后主要是中间产物向终产物POP2的转变，在1—10 h内，POP2的积累速度最快，在10 h后，根皮苷的含量基本不再发生变化，其原因可能是在反应前期，底物迅速与酶活性中心结合，使根皮苷迅速被消耗，但是随着时间的延长，酶活达到极限，根皮苷与酶结合能力变弱，此时转化率达到90.2%，并且中间产物X1已基本转化为终产物 POP2，此后主要发生的反应是POP1向 POP2的转变。GUYOT[29]和 GUERNEVÉ[30]的研究表明在反应时间为5 h时，根皮苷已完全转化为氧化物POP1和POP2，在280 nm处未检测到根皮苷的残留及中间产物X1的生成，5 h后发生的反应是氧化物POP1向POP2的转变，当反应终止时，体系中仅存在POP1和POP2两种氧化物，并且POP2为主要产物，在420 nm处检测到POP2的积累。但不同的是，王雪晖[31]的研究表明反应完成后，在287 nm处同时检测到两种氧化物POP1和POP2的生成，并且POP1为主要产物。通过HPLC追踪根皮苷酶促反应历程发现，根皮苷不能完全转化为POP2，在420 nm处检测到根皮苷氧化物中的主要成分为POP2。根皮苷为苹果的特征性多酚，通过明确根皮苷氧化物POP2的结构和HPLC的检测方法，可以以POP2的含量多少检测苹果汁的掺假。

4 结论

通过多酚氧化酶氧化根皮苷反应体系的建立，明确了根皮苷酶促氧化体系中的主要氧化物为POP2，添加适宜浓度的无水乙醇可以显著提高根皮苷的转化率和POP2的积累；经分离纯化后利用ESI-MS和IR确定了 POP2的结构。此研究结果可为苹果汁中POP2的检测分析及功能评价奠定基础，进而可以用POP2含量的多少建立苹果汁褐变和劣变的标志性检测指标。

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