抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子3代的适合度

闫静，王晓蕾，张玉池，张庆玲，王建，强胜，宋小玲

（南京农业大学生命科学学院，南京 210095）

0 引言

【研究意义】随着生物技术的发展，全球转基因作物的种植面积从1996年的170万公顷增至2016年的1.85亿公顷，种植的国家已达26个。其中转基因油菜（Brassica napus）的种植面积达到总面积的5%，主要种植国家为美国、加拿大、澳大利亚和智利[1]。商业化种植的转基因油菜中主要性状为抗草甘膦和草丁膦性状。美国孟山都（Monsanto）公司将cp4 epsps和goxv247导入到油菜中，得到抗草甘膦转基因油菜；杜邦公司将gat4621转入油菜中获得抗草甘膦油菜；拜耳公司将Bar和Pat导入油菜中，获得抗草丁膦转基因油菜；此外，该公司培育出抗溴苯腈（bromoxynil）的转基因油菜（ISAAA数据库）[2]。抗除草剂转基因油菜的商业化种植在产生经济效益的同时，也存在潜在的生态风险，包括转基因油菜自生杂草化及抗性基因漂移，一旦发生杂草化或基因漂移，将会给农田杂草防除带来很大困难。因此在转基因油菜商业化释放前对其潜在的生态风险进行长期跟踪研究具有重要意义。【前人研究进展】由于油菜的落粒性和二次休眠强等特性，被认为是最容易发生杂草化的作物之一[3-4]。对于抗除草剂转基因油菜而言，由于导入了抗除草剂基因，可能使其具有更强的环境适应能力，从而增加其演化为杂草的可能性[5]。目前已有多个抗除草剂转基因油菜自生杂草化的报道[6-8]。油菜属于异花授粉作物，其花粉可通过风媒、虫媒等途径传播，并与野生近缘种杂交或回交，从而发生基因漂移。在田间条件下，转基因油菜可以和芜菁（B. rapa）[9-10]、芥菜（B.juncea）[11-12]、野萝卜（Raphanus raphanistrum）[13-15]等野生近缘种自发杂交，且能产生携带抗性基因的杂交后代。在评估基因漂移的风险时，除评价转基因作物和野生近缘种能否发生初始杂交外，携带抗性基因的杂交和回交后代的适合度（fitness）是抗性基因能否成功漂移至野生近缘种的另外一个重要评价内容[14,16-17]。适合度是指个体在特定环境下的生存和繁殖能力。转基因逃逸是否会带来生态风险，很大程度上取决于杂交或回交后代的适合度[18]。研究表明，转基因作物与芜菁[9-10,19-23]、芥菜[12]、野萝卜[15,24-25]的杂交或回交后代都具有一定的适合度。其后代的适合度受亲本基因组、基因型[26-27]和环境因素，如种植密度、竞争和选择压[28-31]等的影响。因此对后代适合度的研究要充分考虑各方面因素。在中国与转基因油菜亲缘关系最近的杂草是野芥菜（wildB. juncea）。野芥菜是西北地区和长江流域荒地及农田的重要杂草[32]。在自然条件下转基因油菜和野芥菜能自发杂交[12,33-34]，产生携带抗性基因的F1，虽然F1的花粉育性较低[12]，但杂交后代可以与亲本发生回交，且适合度随回交代数的增加而提高[12,35-37]，因此对转基因油菜与野芥菜回交后代适合度的研究不容忽视。【本研究切入点】笔者实验室前期研究了抗草甘膦[38]和抗草丁膦（待发表）转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子1代和子2代的田间适合度，发现两种抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交 3代子 1—2代的总适合度（composite fitness）在混种条件下存在差异。对抗草甘膦的正反回交3代子1—2代，除正反回交3代子1代在低密度4∶1混种比例下的总适合度，以及正反回交3代子1代在高密度3个混种比例下的总适合度显著低于野芥菜外，其他情况下各回交后代的总适合度均与野芥菜相当。而抗草丁膦的正反回交3代子1—2代中，低密度混种时，在4∶1和3∶2比例下，只有BC3mF3的总适合度与野芥菜无显著差异，在1∶1比例下，只有BC3mF2和BC3mF3的总适合度与野芥菜无显著差异，其余情况下各后代的总适合度均显著小于野芥菜；高密度混种时，3个比例下各回交后代的总适合度均显著小于野芥菜。因此有必要对抗草甘膦和抗草丁膦的正反回交3代子3代田间适合度进行跟踪研究。【拟解决的关键问题】在前期研究的基础上，以携带抗草甘膦转基因油菜和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代为研究对象，在田间条件下研究这些回交后代单种和在与其杂草亲本野芥菜混种下的适合度，为两种抗除草剂转基因油菜的抗性基因渗入野芥菜可能导致的生态后果提供长期的多世代的试验数据，同时也为转基因油菜的安全性评估提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野芥菜采集于南京江浦；抗草甘膦转基因油菜（DS-Roughrider，Roundup Ready，event RT73）和抗草丁膦转基因油菜（Swallow，Liberty Link，event HCN92）均来自加拿大。以野芥菜为母本，抗除草剂转基因油菜为父本人工杂交获得抗草甘膦和抗草丁膦的F1[34]；以野芥菜为母本，F1或者抗性回交代为父本获得正向回交 1、2、3 代（BC1mF1、BC2mF1、BC3mF1），以F1或者抗性回交代为母本，野芥菜为父本获得反向回交 1、2、3 代（BC1pF1、BC2pF1、BC3pF1）[35]，其中抗性BC3mF1与BC3pF1连续套袋自交和抗性筛选3代得到抗草甘膦的正反向回交3代子3代（BC3mF4R和BC3pF4R），以及抗草丁膦的正反向回交3代子3代（BC3mF4L和BC3pF4L），如图1虚线内所表示的材料。

图1 野芥菜和抗除草剂转基因油菜杂交和回交框架图Fig. 1 Crossing scheme of hybridization and backcross between wild Brassica juncea and transgenic herbicide-resistant B. napus

1.2 试验方法

1.2.1 田间种植方法 2014年11月初将经过抗性筛选后存活下来的长势良好、大小适中的植株幼苗移栽至试验田。试验采用的是裂区设计，把田块均匀划分为两个主区，分别是抗草甘膦后代区和抗草丁膦后代区；在每个主区内划分为单种和混种两个副区；在单种副区内再分为低密度和高密度两个密度副区，每个密度副区采用随机区组设计；在混种副区内再划分为低密度和高密度两个副区，在每个密度副区内分别划分出野芥菜∶回交后代比例为4∶1、3∶2和1∶1的3个混种比例副区，每个比例副区内采用随机区组设计。低密度15株/区（1∶1比例时低密度是20株每/区，株距不变，面积扩大）和高密度 30株/区。低密度下，每一区种植3行×5列，高密度下，每一区种植6行×5列。混种种植方法见图2。试验重复3次，共108个小区。

图2 野芥菜与回交后代混种时小区植株分布图Fig. 2 Layout of field experiment in mixed plot

1.2.2 适合度成分测量 所测指标包括营养生长指标（株高、茎粗、一次分枝数、地上部单株干生物量）和生殖生长指标（单株有效角果数、单株种子质量、角果长、每角果饱粒数）。测定方法为株高：成熟后，用直尺测量地上基部到主茎最高处；茎粗：与株高测量同步进行，用直尺测量地上基部的直径；一次分枝数：成熟后统计主茎上的分枝数目；地上部单株干生物量：成熟后测定每株的干生物量[12]；单株有效角果数：单株所有的至少含有一粒饱满或半饱种子的角果数；单株种子质量：每单株种子的总质量；角果长：每株选中下部20个角果测量其长度；每角果饱粒数：与角果长测量同步进行，统计20个角果内的饱满种子数。统计每小区内的全部植株，计算平均值。

1.3 数据统计与分析

数据分析采用SPSS 19.0统计软件进行。单种相同种植密度下，采用 Duncan复极差测验（Duncan’s multiple range test）的方法，分析抗草甘膦或抗草丁膦的正反回交3代子3代和野芥菜的适合度成分及总适合度差异；混种条件下，采用配对样本T检验的方法，分析同一种植密度和比例下抗草甘膦或抗草丁膦的回交后代与亲本野芥菜的适合度成分和总适合度的差异。

各适合度成分的相对适合度值计算方法：以野芥菜为比较的标准“1”，相应回交后代的各项适合度成分与野芥菜的该适合度成分之比为相对适合度值，总适合度值是其各项适合度成分的相对适合度值的加权平均数[26,39]，本试验中总适合度=∑(各指标相对适合度值)/8。

运用SPSS 19.0中的双因素方差分析，对各回交后代的适合度成分与混种时密度以及混种比例的相关性进行分析。

2 结果

2.1 单种条件下BC3F4与野芥菜的适合度成分比较

低密度单种条件下，野芥菜与供试的回交后代生长良好。两种抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代的营养生长指标株高、茎粗、一次分枝数和地上部单株干生物量分别在 151.33—158.01 cm、1.49—1.62 cm、15.07—17.66和 119.96—133.36 g，均与野芥菜无显著差异；生殖生长指标有效角果、单株种子质量、角果长和每角饱粒数分别在1 297.63—1 362.42、25.74—26.68 g、3.42—3.52 cm 和 13.87—15.31粒，也均与野芥菜无显著差异（表1）。

高密度单种条件下，BC3mF4R和BC3pF4R的各适合度成分及总适合度均已达到与野芥菜相当水平，但BC3mF4L和 BC3pF4L有部分适合度成分仍低于野芥菜，其中，BC3pF4L的株高显著低于野芥菜19.22 cm；BC3mF4L和 BC3pF4L的茎粗也均显著低野芥菜 0.30 cm和0.27 cm；且BC3mF4L和BC3pF4L的地上部单株干生物量和有效角果数都显著低野芥菜 19.32 g和19.97 g、228.7和247.25（表1）。

2.2 混种条件下BC3F4与野芥菜的适合度成分比较

2.2.1 低密度混种条件下 BC3F4与野芥菜的适合度成分比较 由表2可知，4∶1混种条件下，BC3mF4R、BC3pF4R和BC3mF4L的各适合度成分与各自混种的野芥菜相比无显著差异，但BC3pF4L的株高和茎粗显著低于野芥菜的151.80 cm和1.56 cm。所有供试材料的一次分枝数和地上部单株干生物量均与各自混种的野芥菜无显著差异；且其生殖生长指标有效角果、单株种子质量、角果长和每角饱粒数分别在 875.33—1 137.44、17.68—23.13 g、3.44—3.46 cm 和 13.55—14.49粒间，也均与各自混种的野芥菜无显著差异。

3∶2混种条件下，所有供试材料的各适合度成分与野芥菜相比无显著差异。营养生长指标株高、茎粗、一次分枝数和地上部单株干生物量分别在 134.15—145.00 cm、1.23—1.30 cm、12.23—13.40和 87.21—99.97 g；生殖生长指标有效角果、单株种子质量、角果长和每角饱粒数分别在 873.8—1118.3、17.43—21.56 g、3.38—3.58 cm和13.83—14.40粒。

1∶1混种条件下，所有供试材料的各适合度成分也与野芥菜相比无显著差异，与3∶2混种条件下结论一致。营养生长指标株高、茎粗、一次分枝数和地上部单株干生物量分别在 144.00—147.73 cm、1.31—1.41 cm、12.82—15.33和100.67—113.63 g；生殖生长指标有效角果、单株种子质量、角果长和每角饱粒数分别为 1 048.73—1105.03、20.50—26.37 g、3.41—3.55 cm和13.63—14.93粒。

2.2.2 高密度混种条件下 BC3F4与野芥菜的适合度成分比较 由表3可知，3个比例混种条件下，BC3mF4R和 BC3pF4R的各适合度成分与野芥菜相比无显著差异，其营养生长指标株高、茎粗、一次分枝数和地上部单株干生物量分别在 129.57—133.95 cm、1.07—1.19 cm、11.67—12.81和69.47—72.86 g；生殖生长指标有效角果、单株种子质量、角果长和每角饱粒数分别在 689.11—766.84、13.83—15.99 g、3.28—3.67 cm和13.04—15.08粒。

但BC3mF4L和BC3pF4L的各适合度成分中，除角果长和每角饱粒数外，其他各个适合度成分均显著低于野芥菜的。株高在125.81—131.22 cm、茎粗在1.06—1.19 cm、一次分枝数在9.36—11.34，地上单株干生物量在 57.67—67.93 g，均显著低于各自混种的野芥菜；有效角果数在 648.21—788.04，单株种子质量在13.30—14.74 g，均显著低于野芥菜的 937.42—1 032.68和19.21—21.33 g。

2.3 单种和混种条件下BC3F4与野芥菜的总适合度比较

2.3.1 单种条件下 BC3F4与野芥菜的总适合度比较在单种两种密度条件下，两种转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子3代的总适合度介于0.89—1.04，与野芥菜相比无显著差异（图 3），表明在无竞争状态下，两种抗除草剂的正反回交3代子3代的总适合度皆已达到与野芥菜相当的水平。

图3 单种条件下BC3F4与野芥菜的总适合度Fig. 3 Composite fitness of BC3F4 and wild B. juncea under pure stands

2.3.2 混种条件下 BC3F4与野芥菜的总适合度比较由图4可知，低密度3个混种条件下，两种转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代的总适合度介于 0.94—1.01，均与野芥菜无显著差异，说明在低密度竞争种植条件下，两种抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代竞争力和野芥菜相当。

高密度3个比例混种条件下，抗草甘膦的正反回交3代子3代的总适合度在0.97—1.01，均与野芥菜无显著差异；而抗草丁膦的正反回交3代子3代的总适合度在0.80—0.82，均显著低于混种的野芥菜。

在高密度竞争条件下，抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代已达到与野芥菜相当的水平，但草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代的总适合度仍然显著低于野芥菜，说明抗草甘膦的回交3代子3代比抗草丁膦的回交3代子3代存在更大的生态风险。

2.4 种植密度和混种比例对野芥菜和 BC3F4适合度成分的影响

由表4可知，种植密度（D）对抗草甘膦转基因

油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代以及野芥菜的有效角果数、地上部单株干生物量和单株种子质量有显著影响，但混种比例（P）及密度与比例的互作（D×P）对其影响不显著；抗草丁膦的正反回交3代子3代的所有适合度成分均受种植密度的影响，混种比例及密度与比例的互作对其影响不显著。

表1 单种条件下BC3F4 与野芥菜的适合度成分的比较Table 1 Comparison of the fitness components of BC3F4 and wild B. juncea under pure stands

表2 低密度混种条件下BC3F4 与野芥菜适合度成分的比较Table 2 Comparison of the fitness component of BC3F4 and wild B. juncea under mixed stands at low density

表3 高密度混种条件下BC3F4 与野芥菜适合度成分的比较Table 3 Comparison of the fitness componentsof BC3F4 and wild B. juncea under mixed stands at high density

表4 双因素方差分析种植密度(D)和混种比例(P)对野芥菜和BC3F4各适合度成分的影响Table 4 Effect of plant density and proportion on the fitness components of wild B. juncea and BC3F4 under mixed stands by Two-way ANOVA

图4 低密度和高密度混种条件下BC3F4与野芥菜的总适合度Fig. 4 Composite fitness of BC3F4 and wild B. juncea at low and high densities under mixed stands

由此可见，种植密度能够显著影响抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代的主要适合度成分，且抗草甘膦的正反回交3代子3代比抗草丁膦的正反回交3代子3代具有更强的竞争力。

3 讨论

抗除草剂转基因作物的抗性基因如果漂移到野生近缘种中，携带抗性基因的后代在选择压下可能会提高其适合度[23,40-42]。适合度是衡量个体或种群在不同生境下的适应程度或者是个体对群体基因库的相对贡献程度，即特定基因型个体在同种生物群体中生存和繁殖后代的能力[18,43]。

转基因作物与近缘种杂交或回交后代的适合度和亲本基因型有关[26,44-45]；且受环境因素的影响，如竞争[26]、种植密度[21,23]和环境压力[23,31]。本试验结果表明，在单种条件下，无论是低密度还是高密度，抗草甘膦和抗草丁膦的正反回交3代子3代均已达到与野芥菜相当的水平，这说明它们在田间环境下有较强的生存能力。前期研究表明两种转基因油菜的抗性回交3代子1代和子2代的总适合度也与野芥菜相当，因此单种条件下回交3代子1—3代的总适合度都具有和野芥菜相当的生存定植能力。这说明防范转基因作物与近缘种间的基因漂移一定要防范 F1与近缘种之间的回交。

在低密度3个比例混种条件下，抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代的总适合度均与野芥菜无显著差异；但在高密度3个比例混种条件下，抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代的总适合度与野芥菜无显著差异，而抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代的总适合度显著低于野芥菜。前期研究表明，在低密度混种条件下，4∶1比例种植时抗草甘膦的正反回交3代子1代的总适合显著低于野芥菜[38]；4∶1和3∶2比例种植时，抗草丁膦的正反回交3代子1代和反向回交3代子2代的总适合度均显著低于野芥菜；1∶1比例种植时，抗草丁膦的反向回交3代子1代和子2代的总适合度也显著低于野芥菜。随着自交代数的增加，两种抗除草剂的回交3代子3代均能达到与野芥菜相当的水平。在高密度3种比例种植条件下，抗草甘膦的正反回交3代子1代的总适合度显著低于野芥菜，随着自交代数的增加，抗草甘膦的正反回交3代子2代和子3代均达到与野芥菜相当的水平[38]；但抗草丁膦的正反回交3代子1—3代的总适合度始终显著低于野芥菜（待发表）。

由上述可知，抗草甘膦的回交后代比抗草丁膦的回交后代存在更大的生态风险，这一结论通过相关性分析可以证实。相关性分析结果表明，抗草甘膦的正反回交3代子3代的一次分枝数、角果长和每角饱粒数与种植密度相关性不显著，但抗草丁膦的正反回交3代子3代的所有适合度指标均与种植密度显著相关。

导致抗草丁膦后代和抗草甘膦后代在竞争条件下的适合度不同，可能的原因是亲本基因型不同。HUANGFU等[27]研究了4种不同地理种群野芥菜与抗草甘膦转基因油菜杂交后代的花粉育性和结实量，发现不同种群的杂交后代间存在显著差异；郑爱琴等[36]研究了抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的F1与5种常规栽培油菜的回交1代，发现这5种回交1代的适合度存在差异。本研究中所用的抗草甘膦转基因油菜和抗草丁膦转基因油菜的基因型不同，可能是导致两种转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子3代适合度不同的原因之一。因此，对转基因油菜与野生近缘种杂交和回交后代的研究应该考虑亲本基因型的影响。

转基因油菜与近缘种的杂交后代可以不断自交或与野生近缘种回交，使得抗性后代的染色体越来越接近野生近缘种甚至与野生近缘种相同，因此后代的适合度也会不断提高。这在转基因油菜与芜菁的回交后代中[10]以及转基因油菜与野萝卜的杂交和回交后代中[24-25,46]得到证实。理论上讲，转基因油菜和野芥菜的回交后代的染色体数量应该是变化的，且变化范围介于20（2A）+ 8（B）+ 0-8（B）+ 0-9（C）之间。C染色体由于在减数分裂过程中没有同源染色体配对而随着代数的增加趋于逐渐丢失[19]，因此随着回交或自交次数的增加，后代染色体趋于稳定，适合度也应不断提高。本试验中，抗草甘膦后代适合度提高的速度较抗草丁膦的后代快，这也可能是由于抗草甘膦基因位于 A-染色体组，而抗草丁膦基因位于 C-染色体组。如果抗草丁膦基因位于C-染色体上，在草丁膦选择压下 C-染色体被保留在回交后代中，导致抗草丁膦后代的 C-染色体丢失速度较慢，因此适合度提高较慢，但这一推论还有待进一步研究证实。因此对外源基因的插入位点也要综合考虑到适合度评价研究中。

MERCER等[26]研究发现，在与小麦竞争条件下，抗磺酰脲类转基因向日葵（Helianthus annuus）和野生向日葵的 F1种子量显著低于在无竞争条件下的种子量；HALFHILL等[47]研究发现，在与小麦竞争条件下，转Bt油菜与芜菁的回交2代子1代的单株干生物量显著低于在无竞争条件下的单株干生物量；SIMARD等[29]研究表明，抗草甘膦基因、抗草丁膦基因和抗咪唑啉酮的3种转基因油菜之间自发产生的抗2种除草剂的杂交后代在与小麦竞争条件下的种子量仅达到在无竞争条件下的64%；HAUSER等[22]研究了在6个混种比例及单种条件下，甘蓝型油菜与芜菁的杂交及回交后代的适合度，发现混种条件下回交1代和两亲本的结实量低于单种条件下的结实量。本试验中，仅在高密度混种条件下，抗草丁膦的正反回交3代子3代的总适合度显著低于野芥菜，在单种无竞争条件下，其适合度与野芥菜无显著差异。由此可见，本试验设置的竞争只对抗草丁膦的正反回交3代子3代产生了显著影响。尽管如此，由于抗草丁膦的正反回交3代子3代在高密度竞争条件下仍可以结出 600多个有效角果，且每个角果都可以产生近13粒饱满种子，这就意味着单株植物可以产生7 800粒种子，因此抗草甘膦基因和抗草丁膦基因向野芥菜的基因逃逸风险同样都不可忽视。

油菜在高密度条件下的结实量会降低[48-49]；种植密度也对转基因作物与近缘种的杂交或回交后代的适合度有影响。HAUSER等[22]研究了在3种种植密度及单种条件下甘蓝型油菜与芜菁的杂交及回交后代的适合度，发现低密度条件下的结实量较高；JOHANNESSEN等[50]证实提高种植密度能降低油菜和芜菁 F1的有效角果数、单株产量和地上部干生物量。本试验中，抗草丁膦的正反回交3代子3代在低密度条件下的适合度与野芥菜相当，但在高密度条件下的适合度显著低于野芥菜，说明提高种植密度会降低抗草丁膦回交后代的适合度。

选择压对后代适合度也有显著影响，VACHER等[23]发现转Bt油菜与芜菁的F1在无虫压条件下比芜菁少产生 6.4倍种子，而在高虫压条件下比芜菁多产生 1.4倍种子；LONDO等[31]研究了抗草甘膦转基因油菜与芜菁的回交1代的单株生物量和种子数量，发现在漂移的草甘膦选择压下，携带抗草甘膦基因的回交后代相对于不携带抗性基因的后代适合度明显提高。本试验是在自然田间条件下进行的，尚未研究草甘膦或草丁膦不同剂量选择压对适合度的影响，因此，供试后代在不同剂量除草剂选择压下的适合度还待进一步深入研究。

转基因油菜与近缘杂草回交后代种子的扩散是转基因油菜逃逸的一种重要途径[5,51]，因此种子在不同环境下的萌发能力是决定其逃逸的重要因素。笔者研究室在温室测定了这些后代的出苗率，发现出苗率与野芥菜均无显著差异，可达90%以上，但对回交3代子3代的种子在不同环境下的萌发能力还有待进一步研究。

4 结论

抗草甘膦或抗草丁膦的正反回交3代子3代都具有在野外生存定植的可能性，且抗草甘膦的回交3代子3代比抗草丁膦的回交3代子3代的可能性更大。因此，在防范转基因作物的基因逃逸时不仅要防范转基因作物与近缘杂草的初始杂交，而且要防范杂交后代与近缘杂草的不断回交，以免产生适合度较高的回交后代。

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