林奇综合征相关性子宫内膜癌的研究进展

支文雪，詹 阳

（首都医科大学附属北京妇产医院 病理科，北京 100006）

林奇综合征（lynch syndrome，LS），既往称为遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC），是一种常染色体显性遗传病，由DNA错配修复（mismatch repair，MMR）基因 MLH1、MSH2、MSH6 或（和）PMS2的胚系突变导致微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）而引起。其家族易感者一生中均具有发展成癌的危险性，主要表现为结直肠癌、子宫内膜癌及其它的癌，包括小肠癌、胃癌、胆管癌、卵巢癌、肾盂/输尿管癌、皮脂腺肿瘤等。LS患者约占所有子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）患者的2%～3%，EC是LS患者肠外最常见的肿瘤，约50%的LS女性患者临床首发症状表现为EC[1]，因此 LS相关性EC（LS-EC）逐渐成为医学界关注的焦点之一。确诊EC与LS相关对LS患者及其家属的早期诊断、筛查和预防等均有重大意义。近年来，欧美等发达国家对于LS-EC的研究取得了长足进展，但国内相应的研究仍处在起步阶段，并未得到相应的重视。本文将就LS-EC的相关分子机制、检测方法、临床病理意义等方面的研究进展进行综述。

1 分子机制

LS 患者由错配修复（mismatch repair，MMR）基因胚系突变导致。当 MMR 基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）有缺陷时，错配不能被修复进而产生突变，尤其是在微卫星这种具有重复序列的区域，从而产生微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）表型。MMR中不仅有不同种类基因的突变差异，而且也有突变类型的差异。首先，突变类型分为沉默（非病理性）和有害（致病性）突变。其次，有害（致病性）突变再分为截短和非截短突变。截短突变或导致表达丧失，或表达一种易降解的MMR蛋白。非截短突变为错义突变，它是一种点突变，导致MMR蛋白内的氨基酸替代，并影响其化学稳定性或功能。有害突变通常会导致MMR蛋白的免疫组织化学染色阴性，然而其中的错义突变导致的功能改变使MMR蛋白仍为免疫反应性，因此免疫组化染色阳性（正常）。一个MMR基因发生双等位基因改变/失活才能造成蛋白缺失（二次打击模型），在MMR基因胚系突变患者中，第二等位基因可经体细胞突变和杂合性缺失激活[2]。大约1/3的临床怀疑为LS的病例（实际为散发性病例而非遗传性家族患者）并没有可识别的致病性突变，其机制是可能为MLH1或MSH2的表观学突变而非胚系突变[3]，其特征是启动子甲基化和等位基因的转录失活。Ligtenberg等人证实上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）基因胚系缺失也会导致临近的MSH2基因沉默。EPCAM基因位于MSH2基因的5'末端，该基因3'末端的胚系缺失会导致上皮细胞中MSH2基因沉默，从而产生MSI表型[4]。

2 检测方法

LS的诊断始于上世纪80年代，诊断标准几经修订[5]，AmsterdamⅠ和Ⅱ标准（发表于1990年及1999年）主要是根据年龄、个人史及其家族肿瘤病史等临床资料进行诊断，这也是临床上诊断林奇综合征的标准；Bethesda指南在2004年制定了修订版，与之前的Bethesda指南相比，修订版更加注重MSI检测的意义。对于MSI表型的检测主要有两种方法：MSI分析（MSI testing）及免疫组化检测。

2.1 MSI分析（MSI testing）

1997年由美国国立癌症研究所（national cancer institute，NCI）在“微卫星不稳定和复制错误表型在肿瘤检测和肿瘤家族性预测中的应用研究会”上发起对于HNPCC进行微卫星状态的检测[6]。该会议推荐5个微卫星序列标记，即 BAT25、BAT26、D5S346、D2S123 和 D17S250；并按微卫星不稳定性发生频率分为3型：其中有2个或2个以上发生微卫星不稳定性现象称为高频MSI（MSI-H）；如1个发生微卫星不稳定性现象称为低频MSI（MSI-L）；如没有发生微卫星不稳定性现象称为微卫星稳定（MSS）。该检测需要肿瘤组织及正常组织同时进行PCR扩增。因为MSS与MSI-L具有相似的生物学行为，将其均归为MSI阴性（-），而将MSI-H定义为MSI阳性（+）。

2.2 免疫组化检测

相对而言，一组由4个最易改变的MMR相关蛋白（MSH2/MSH6/MLH1/PMS2）组成的免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检测项目在试验研究及临床应用中最为普遍。相应的抗体在正常黏膜及周围间质和淋巴细胞中为核阳性，当肿瘤组织的核未着色时判定为（-），当出现任一项抗体染色阴性时则判定为 MSI（+）[5]。

IHC检测结果与MSI分析有很高的一致性，二者比较，IHC检测操作方便、花费较少，同时有利于直观确定突变的基因。在EC中使用IHC方法检测MSI和筛查LS患者是非常有效的[7，8]。对于MSI分析和免疫组化检测结果不一致的病例大部分是由于MLH1启动子高甲基化或者MMR基因变体；MMR蛋白异质性表达则一般是由于MLH1启动子高甲基化或者肿瘤本身显微切割区域对于MSI有异质性，最常见的是蛋白表达的亚克隆性丢失（未着色细胞占肿瘤细胞的10%～90%）[9]。通过IHC检测肿瘤样本的MMR蛋白表达情况而对LS的普遍筛查，已使多种异质性的MMR染色模式得到了解释，在一项前瞻性的研究使用IHC在125例EC中进行LS普筛，发现MMR蛋白表达的亚克隆缺失在EC中高达7.2%，且一般发生于子宫内膜样癌中。MLH1亚克隆缺失似乎是一种生物学现象，可以通过甲基化和体系突变事件来解释，而非胚系突变[10]；单独的PMS2蛋白缺失可能同样由于MLH1启动子高甲基化的异质性[11]；然而MSH6蛋白丢失 （伴或不伴MSH2蛋白亚克隆丢失）的分子机制仍不十分清楚[12]。

2.3 其它

在LS的筛检流程中，对于存在 MLH1免疫组化表达缺失的肿瘤，需要进一步行甲基化检测以判定MLH1基因启动子有无超甲基化。如果存在甲基化，更可能是散发性子宫内膜癌，而非LS-EC。经IHC或MSI分析方法发现MSI病例，排除MLH1甲基化者，剩余病例则需进行 MMR基因胚系突变检测来最终诊断是否为LS患者。MMR基因胚系突变检测一般从外周血或从手术切除的正常组织中提取基因组DNA，然后进行测序。随着二代测序技术的发展及检测平台的出现，MMR基因胚系突变的检测成本越来越低，检测周期也越来越短。Bente等人运用二代测序技术在HNPCC患者和EC患者中检测总大小为1.161 Mb的22个MMR基因的外显子或内含子 （包括 MLH1，MSH2，MSH6，PMS2，MSH3，PMS1，MLH3，EXO1，RFC1，RFC2，RFC3，RFC4，RFC5，PCNA，LIG1，RPA1，RPA2，RPA3，POLD1，POLD2，POLD3和POLD4基因）来筛选致病性种系突变，发现了5个外显子的插入/缺失突变、42个外显子非同义单核苷酸变体和1个内含子显著性变异。检测结果既发现了以往传统测序已经证实的致病性种系突变如MSH2基因的c.187_188insGG突变，也发现了新的突变，从而提出非常规检测的基因可能通过与致病基因的多基因相互作用在HNPCC患者的癌症发展中起作用。研究者同时认为有必要采用新的检测策略来改善风险评估和预防措施，以减轻这种易感人群的疾病负担[13]。现在有几家公司正在生产测序套餐和试剂盒来促使MMR基因的大规模测序得以实现[14]。

3 临床病理意义

3.1 临床病理特征

患有LS的女性一生中罹患子宫内膜癌的风险为40%～60%，较其患结肠癌的风险等同或者更高。家族史和个人病史与肿瘤检测的结合为诊断EC的女性LS患者提供了有效的方式。MLH1或MSH2基因突变者发生EC的风险为25%～60%，MSH6基因突变者发生 EC的风险为16%～26%，而PMS2基因突变者为15%[15]。对于EPCAM缺失的携带者发生子宫内膜癌的累积风险率为12%，这种风险局限于MSH2基因启动子外延的缺失[16]。女性LS患者的干预措施包括预防性子宫双附件切除术和化学性预防。对于LS家系的监测根据携带不同的突变基因型而定，对于MLH1/MSH2基因突变携带者，建议从20～25岁开始每1～2年做1次肠镜、妇科及泌尿道检查；MSH6/PMS2基因突变携带者，则建议从25～30岁开始每1～2年做1次肠镜检查和妇科检查[17]。

与具有明显临床病理特征的MSI（+）结直肠癌不同，MSI（+）与 MSI（-）子宫内膜癌之间的临床病理特征的差异并不十分明确。大多数研究并没有发现在子宫内膜癌中MSS患者与MSI患者之间的发病年龄存在差异。然而进一步按照是否有胚系突变分组后发现LS-EC患者较为年轻，LS-EC平均发病年龄为53.4岁，散发性MSI-EC平均发病年龄为63.6岁，MSS-EC平均发病年龄为66.8岁[18]。MSI相关子宫内膜癌更多见于子宫内膜样癌和 I型癌中，可能表现出其特有的组织学特征，包括筛状结构、粘液分化、坏死、无乳头生长及肿瘤异质性[19]。有研究显示，子宫内膜癌中MSI与淋巴细胞浸润的相关性。与MSS相比，MSI-H者间质中免疫细胞增多，包括粒酶B+细胞，活化的 CTLs细胞和 PD-L1+（程序性细胞死亡配体 1，programmed cell death ligand 1）细胞。在 MSI-H的EC中散发性EC和LS-EC中在免疫细胞群中表现出明显的差异，表明微卫星不稳定性的机制改变了免疫应答。MSI-H的LSEC中间质中CD8+细胞和活化的CTL细胞增多，间质和肿瘤中的巨噬细胞减少[20]。这些数据近期被Sloan等研究者证实，他们的研究表明LS-EC中PD-L1表达增强[21]。

3.2 预后及治疗

一直以来，对于MSI-H与肿瘤预后之间的关系有很多的研究。针对EC有研究发现具有MSI的早期EC更易出现淋巴血管间隙浸润，且更易发生远端复发并影响总体生存[22]；Talhouk等同时也发现MMR蛋白缺陷的EC患者更易出现淋巴血管间隙浸润，分期更晚，更易出现在接受放化疗的“高危”患者中[23]，然而迄今为止仍没有公认的确切研究结果。

临床研究中发现微卫星状态与肿瘤对化疗的反应有关。在MSI阳性结肠直肠癌患者中，研究5-氟尿嘧啶（5-Fu）疗效的研究结论认为与MSS肿瘤相比，MSI阳性结肠直肠癌对化疗药物的反应不同，其患者并不能从以5-Fu为基础的辅助化疗中获益[24]。子宫内膜癌的化疗方案一般以铂类和紫杉醇为基础，MSI与子宫内膜癌化疗的相关性仍不明晰，需要更多的临床随机前瞻性或回顾性研究。

近年来对于恶性肿瘤靶向治疗的研究广泛开展，其中在MSI（+）肿瘤与免疫靶向治疗之间的研究更是取得了重大成果。研究者发现使用抗PD1（程序性细胞死亡1，programmed cell death 1）的免疫检查点抑制剂pembrolizumab（帕母单抗）治疗的患者中，MMR缺陷结直肠癌者表现出较MMR未缺陷者更高的免疫相关反应率和免疫相关无进展生存率；而其他种类MMR缺陷肿瘤（非结直肠癌）患者较未缺陷者存在更多的体细胞突变（P=0.007），而高体细胞突变负荷与延长无进展生存期相关 （P=0.02）[25]。2017年5月美国FDA批准了将抗PD1与PDL1的免疫抑制剂应用于MSI-H的实体肿瘤。Sloan等人评估了PDL1在MMR缺陷的子宫内膜癌（包含LS-EC与MLHI高甲基化者）与未缺陷者中的表达情况，发现LS-EC相对于MLH1甲基化者 （散发性MMR缺陷子宫内膜癌）PDL1阳性率更高（70%vs 33%，P=0.05），而只有10%未缺陷者表达PDL1，这显著低于在MMR缺陷型肿瘤中的阳性率（P=0.0005）；MSH6蛋白缺失与PDL1表达最相符[21]。该研究表明，相对于MLH1甲基化和MMR未缺陷肿瘤，肿瘤性PD-L1表达在LS-EC中更常见，MMR缺陷可能是EC对PD-1/PD-L1抑制剂治疗反应中的预测指标，为将来LSEC的个体化治疗提供了更多的选择。

4 小结

针对LS-EC的研究大多为国外研究，国内研究尚处于起步阶段，尽管大部分病理科已经开展针对MMR蛋白的免疫组化检测，然而国内对于遗传性肿瘤的家系筛查、遗传咨询及遗传家族的健康管理仍然比较滞后。鉴于其临床意义重大，我们希望通过这篇综述引起妇产科及病理科医生对于LS-EC的足够重视，同时希望国内能够开展大规模、多中心的研究来获得中国人群中LS-EC的发生率、临床病理特征、基因改变、预后相关性和治疗预测价值等信息，以填补该研究领域的空白。