脑出血后炎症损伤相关信号通路的研究进展

江 珊综述， 俞晓飞审校

炎症损伤是脑出血后促成脑损伤的重要因素，其始动环节是小胶质细胞的活化，继而炎症细胞渗出、炎症介质释放，交叉应答后通过多种不同信号通路造成血脑屏障破坏、组织水肿、细胞死亡等脑组织病理性变化。近年来针对脑出血后炎症损伤机制的研究层出不穷，各种炎症损伤信号通路的提出使脑出血的靶向治疗成为可能，但其临床死亡率和致残率却未见明显改善。本文综述了近年来脑出血后炎症损伤相关信号通路的研究及其进展，旨在为研究者提供新的思路和方法。

脑出血是神经内科的一种常见疾病，其发病率占全部脑卒中的10%～15%[1～3]。过去20年里，脑出血的高死亡率及高致残率并未随着医学的进步而降低[4]，虽然对其损伤机制的研究探讨已相当深入，但改善其临床疗效仍有一定的困难，而这也正是我们需要努力的方向。

脑出血发生后，血肿形成，机械性压迫周围脑组织，造成初级损伤；同时血肿中血液成分如红细胞、凝血因子等会激发细胞毒性、兴奋毒性、氧化应激反应和炎症反应，造成继发损伤[5]。临床数据表明，脑出血体积、血肿扩大程度均与临床不良结局相关，因此早期去除颅内血肿至关重要[6]。但Mendelow等[7]研究表明，早期外科去除血肿并未有效改善临床结局。因此，血肿造成的继发损伤成为影响脑出血结局的关键因素[8]。大量研究[9，10]表明炎症损伤是介导继发损伤的主要病理机制，最终造成血脑屏障破坏、组织水肿、细胞死亡等病理性变化。

目前国内外脑出血后炎症损伤机制研究主要涉及小胶质细胞活化、血脑屏障通透性改变、组织水肿、细胞凋亡等，且已深入至信号通路方面。如何有效阻断炎症损伤信号通路为脑出血治疗提供了研究方向，但因信号通路机制的复杂性所在，学者们各抒己见，观点不一。神经血管单元(neurovascular unit，NVU)是神经系统的结构和功能单位，由神经元、血脑屏障(blood brain barrier，BBB)、小胶质细胞及细胞外基质构成，其中BBB是其核心组成，成分包含星形胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、紧密连接及基底膜[11]。本文主要对脑出血后神经血管单元炎症损伤相关信号通路研究进展作一综述。

1 小胶质细胞活化与极化相关信号通路

小胶质细胞作为中枢神经系统中重要的固有免疫细胞，是第一个对脑出血损伤迅速反应的非神经元细胞。生理状态下，小胶质细胞通过细胞突起监测周围微环境，维护着神经元、血脑屏障、基质的稳态；一旦脑出血发生，即被迅速激活，通过吞噬作用清除血肿及坏损细胞碎片，为组织修复创建有利环境。但过量激活后，其将释放促炎症因子诱导循环系统中炎症细胞浸润，后者继而释放大量炎症因子并通过不同信号通路诱发炎症瀑布反应，最终造成血脑屏障破坏、组织水肿、细胞死亡等病理性变化[12]。目前关于小胶质细胞的信号通路研究集中在其活化和极化二个方面。

1.1 活化相关信号通路 脑出血后1 h内，小胶质细胞即表达上升，72 h到达高峰并持续至3～4 w[5，13]。Lin等[14]研究表明脑出血早期坏死神经元、血肿成分如凝血酶、纤维蛋白、亚铁血红素等可激活CD11b+小胶质细胞，上调Toll 样受体 4(TLR4)表达，并通过髓样分化因子 88(MyD-88)和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)通路活化核因子-κB(NF-κB)，后者上调促炎症因子基因表达，进而加剧炎症反应。除了TLR外，凝血酶通过PAR-1(protease-activated receptor-1，PAR-1)通路[15]或MAPK (mitogen activated protein kinase，MAPK)通路[16]同样能激活小胶质细胞。近期学者们从自噬角度研究小胶质细胞活化反应，Shi等[17]发现IL-17A通过自噬基因ATG5和ATG7能够促进小胶质细胞的活化，利用RNA干扰则抑制了自噬反应和小胶质细胞的活化；Yuan等[18]也提出自噬基因BECN1和ATG5在刺激小胶质细胞活化中发挥着重要作用。

1.2 极化相关信号通路 小胶质细胞活化后表达了两种类型的细胞，即具有促炎性作用的M1型和抗炎性作用的M2型[19，20]；其活化后最初表达的是M2型，吞噬红细胞及清除破损细胞碎片以为组织修复创造有利微环境。但随着时间的延长，小胶质细胞的活化表达分型开始向M1型转化，该型细胞释放大量炎症介质如IL-1β、IL-6、TNF-α诱发炎症瀑布反应，造成一系列脑损伤[21]。近期Chang等[22]通过实验研究表明小胶质细胞在脑出血后1～1.5 h即已活化，并最初呈现M2型保护作用。但随着时间延迟，其表现型呈现混合态，最终成为经典M1表现型，后诱发炎症反应。该实验同时证明了M2型小胶质细胞在促进脑出血后血肿吸收及改善神经功能缺损中的重要作用。Yu等[23]研究同样证明了这一观点，他们利用miR-124模拟物及抑制剂干预脑出血小鼠模型，结论表明miR-124通过C/EBP-α信号通路调节小胶质细胞向M2型转化，从而减轻脑出血后炎症损伤。另一研究[24]利用生松素干预脑出血小鼠模型，结果显示生松素能够减少经典M1型小胶质细胞，而对M2型小胶质细胞无影响；实验结论表明抑制M1小胶质细胞活性能够减轻脑出血后血肿体积及改善神经功能缺损。因此，诱导小胶质细胞向M2型转化或抑制其M1型活性有可能成为缓解脑出血后炎症损伤的突破点。

Chang等[22]关于小胶质细胞极化促进脑出血后血肿吸收的研究发现，脑出血小鼠腹腔注射IL-10，能够加速血肿吸收；而使用IL-10拮抗剂时，小胶质细胞吞噬作用减弱，表明IL-10信号通路可能介导了小胶质细胞的极化。Zhou的研究[25]进一步发现，调节性T细胞能够通过IL-10/GSK3b/PTEN信号通路促进小胶质细胞向M2型转化从而缓解脑出血后炎症损伤。不同的是，Yang的研究[9]提出调节性T细胞缓解脑出血后炎症损伤作用是通过JNK/ERK通路活化NF-κB后抑制小胶质细胞的活化实现的。此外，Fang等[26]研究认为抑制TLR4能够上调小胶质细胞表达CD36以促进血肿吸收。实验发现TLR4-/-小鼠或MyD-88-/-小鼠或使用TLR4拮抗剂TAK-242小鼠脑出血血肿区域CD36表达均上升，且血肿吸收明显被促进；而CD36基因缺陷小鼠血肿吸收则明显减慢；结论表明脑出血后抑制TLR4信号通路上调小胶质细胞表达CD36是促进血肿吸收的重要路径。Lan等[24]进一步研究认为这与M1型小胶质细胞表达减少相关。但关于小胶质细胞表型与CD36分子表达关系仍需进一步研究探索阐明。

2 以血脑屏障各构成成分为靶点的相关信号通路

血脑屏障是大脑维持内环境稳态的一道重要防线，由内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞和基质构成，其中血管内皮细胞通过紧密连接蛋白相连[27]。脑出血后，炎症细胞浸润、炎症介质释放，交叉应答后通过多种不同信号通路引起细胞毒性作用、基质破坏、紧密连接蛋白疏松，造成血脑屏障通透性改变，诱发脑水肿等一系列病理性损害[28]。

2.1 血管内皮细胞 血管内皮细胞是构成血脑屏障的主要细胞[29]，细胞间通过紧密连接相连，共同构成血脑屏障结构和功能的基础。脑出血后凝血酶刺激脑微血管内皮细胞表达miR-130a，后者在脑出血患者血浆中明显升高且被认为是脑出血发生最早3 d内水肿体积的独立监测指标。动物实验同样发现miR-130a在大鼠血浆及脑出血血肿周围组织中表达明显增加且与水肿变化有一定关系；使用其抑制剂后脑水肿和血脑屏障通透性减轻，且神经功能缺损评分改善。机制研究方面，miR-130a表达增加的同时伴随着质膜微囊蛋白caveolin-1的减少和MMP-2和MMP-9(matrix metalloproteinase，MMP)的增加，作者提出凝血酶诱导的血管内皮细胞产生的miR-130a能够通过caveolin-1-MMP2/9信号通路改变血脑屏障通透性加重脑水肿[30]。Xi等[31]认为miR-126能够通过降低PIK3R2抑制血管性炎症及促进血管再生，其具体调节机制可能是miR-126靶向PIK3R2激活PIK3/AKt信号通路后微调血管内皮生长因子(VEGF)信号通路及增强Ang-1活性，其中VEGF和Ang-1对维持紧密连接和黏合连接完整性有着重要作用。除了miRNAs研究之外，Xiong等[32]研究认为脑出血后铁调素介导的血管内皮细胞胞内铁交换异常致胞内铁积聚会引起氧化损伤加剧炎症反应，实验发现造模后的TLR4-/-和MyD-88-/-小鼠血管内皮细胞胞内铁积聚较野生型小鼠明显改善，其分子机制可能是TLR4/MyD-88信号通路促进IL-6表达及STAT3磷酸化后介导铁调素上调，导致血管内皮细胞胞内铁的积聚；干预TLR4信号通路减少胞内铁积聚缓解炎症反应有可能成为改善脑出血后炎症损伤的重要途径。

2.2 星形胶质细胞 星形胶质细胞是大脑内最丰富的胶质细胞类型，具有重要的抗氧化损伤作用[33]。脑出血后，死亡的红细胞释放大量亚铁离子，流入细胞内诱发氧化应激反应致神经元死亡。但星形胶质细胞往往却能自我修复，Cui等[34]认为这与星形胶质细胞中核因子-红系-相关因子2(Nrf2)活化相关，其机制可能是与上调抗氧化基因HO-1相关；这在Roetling. J的研究[35]已被证明，脑出血小鼠星形胶质细胞HO-1的过度表达具有神经保护功能。然而，星形胶质细胞在脑出血后同样具有破坏性作用。Min等[36]研究发现脑出血后TLR2诱导星形胶质细胞表达MMP9，破坏血脑屏障，加剧炎症反应。实验通过明胶酶活性检测、免疫组化等比较TLR2基因敲除小鼠与野生型小鼠，发现TLR2上调星形胶质细胞分泌MMP9，后损害血脑屏障，加剧炎症反应造成脑损害。

2.3 周细胞 周细胞位于血脑屏障系统血管内皮细胞周边，且与之共用基底膜，共同维持着血管的低渗透性[37]。周细胞与血管内皮细胞、星形胶质细胞、神经元之间相互交流，协同调控神经血管单元功能[38]；相关机制可能与调节血管内皮细胞表达特殊基因，或是诱导星形胶质细胞活化形成伪足保护血管系统相关[39]。脑出血后，凝血酶诱导了MMP9的释放，对比参与血脑屏障构成的星形胶质细胞、血管内皮细胞和神经元，发现其表达量在周细胞中最高，而这可能与周细胞较高表达凝血酶受体PAR1和PAR4相关；其中PAR1在周细胞上的数量是最丰富的，且使用PAR1抑制剂SCH79797后能够阻止周细胞释放MMP9，这提示周细胞的凝血酶-PAR1-MMP9轴在脑出血血脑屏障破坏病理进程中的重要作用[40]。新近研究[41]在此基础上继续探索了其分子机制，并提出脑出血后凝血酶刺激周细胞上PAR1，活化PKCh-Akt 和PKCd-ERK1/2信号通路，进而释放MMP9，引起血脑屏障破坏，加剧脑损伤。

2.4 以基质及紧密连接为靶点的信号通路 血脑屏障系统除了血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞外，细胞外基质及紧密连接也是其主要组成[42]，细胞外基质被破坏显著增加了血脑屏障的通透性[28]。基质金属蛋白酶是一个超大锌-内切酶家族，能够降解细胞外基质及内皮细胞间的紧密连接，导致血脑屏障结构和功能破坏，引起脑水肿[43]。一直以来对基质金属蛋白酶家族成员重点研究的蛋白主要是MMP-9，且大量研究证明了脑出血后MMP9对血脑屏障的破坏作用[44]。Hamann等[45]更进一步研究认为活化的MMP9是通过降解细胞外基质的层粘连蛋白、胶原酶及紧密连接蛋白参与损害血脑屏障的。新近研究着重于MMP9产生途径的信号通路，Min等[46]研究认为脑出血后亚铁血红素刺激星形胶质细胞释放TLR2，TLR2活化后引起MMP9表达增加，最终造成血脑屏障受损，引起脑损伤。Machida等[41]研究表明脑出血后凝血酶与周细胞上PAR1作用，活化PKCh-Akt和PKCd-ERK1/2信号通路，进而释放MMP9，引起血脑屏障破坏，加剧脑损伤。

神经系统疾病发生时，细胞外基质适应性变化，这表明了血脑屏障是一个动态的结构组成[47]。因此以细胞外基质为靶点，调节基质环境，阻断炎症因子与基质结合或切断细胞间分子交流通道，可能将会为脑出血的治疗提供一种新的研究方向。

3 以神经元为靶点的相关信号通路

神经元是神经功能的基本单位。脑出血后，血肿机械性压迫、脑水肿、缺血缺氧、炎症反应、氧化应激、细胞毒性等都会造成神经元受损[48，49]。动物实验自体血注入大鼠颅内，当天就能在神经元内检测到大量血红素[50]；体外培养细胞实验也观察到锡原卟啉在2 h内就大量进入神经元[51]。血红素进入神经元后，在HO-1作用下降解，此过程需要消耗大量的能量和抗氧化剂，以至于神经元内氧自由基清除减少，细胞氧化应激损伤加重[48]；另一方面，血红素降解产物胆红素和铁也在实验中被证明了对神经元的损伤作用[52，53]。目前关于脑出血后神经元凋亡研究尚在蛋白水平。Dai等[54]研究发现脑出血后Kpnb1与caspase-3共定位于神经元，表明了Kpnb1蛋白介导了神经元凋亡。Zhang等的实验[55]利用免疫荧光检测发现血管细胞粘附分子(VCAM1)在神经元中显著增加，免疫荧光共定位发现凋亡蛋白caspase3及bcl-2均与VCAM1共存；表明VCAM1也参与到脑出血后神经元凋亡的病理性改变中。

4 总结

综上所述，脑出血后炎症损伤是一个极其复杂的过程，不是某一细胞、某一分子、某一通路的单一炎症反应，而是整个脑组织应对损害时的协调反应。小胶质细胞活化、血脑屏障破坏、神经元凋亡等从单一细胞或分子层面研究脑出血后脑损伤，虽然也取得一定疗效，但并未明显改善临床死亡率及致残率，这可能与将整体神经血管系统分割开单独研究而忽略了整体性相关。近期有研究发现小胶质细胞活化后能够分泌IL-1α，TNF，C1q激活星形胶质细胞，并产生神经毒性[56]，这表明神经血管单元是一个相互应答的系统，自分泌、旁分泌或细胞间应答等都会引起整个系统的应激反馈，最终造成不可逆转的脑损害。因此药物干预以神经血管系统整体为靶点，多方向、多角度、多途径的进行保护，可能会成为未来脑出血后治疗的希望。