蛋白质组学在肉类研究中的应用研究进展

侯 然，卢士玲，王庆玲，姬 华，李文慧，董 娟*

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

近年来，肉类消费的高速增长推动肉类生产规模持续扩大、产业结构升级和产品的多样化，这些均对肉类产品的生产加工、品质等方面提出了更高的要求。肉与肉制品品质一直都是消费者关心的重要问题。肉类品质的变化主要体现在肉的嫩度、色泽、风味、保水性及营养价值等方面[1-3]，肉类品质变化的作用机制仍需深入研究。1986年，已经有学者提出以基因组为单位，研究基因组的结构、功能及表达产物的基因组学[4]。随着基因组学的发展，许多学者应用基因组学对影响肉类品质的基因进行研究，为肉类研究提供了新的方法[5]。基因组学旨在解析生命的全套遗传信息，系统研究这些遗传信息代表的生物学功能引起了科学家们的兴趣，由此产生了蛋白质组学[6]。2001年，蛋白质组学成为仅次于干细胞研究的六大热点之一[7]。经过多年发展，以蛋白质为基础的蛋白质组学在诸多领域被应用，其中差异蛋白质组学发展特别迅速。如今，蛋白质组学已经成为肉类研究的策略之一，并且已经被证明是研究肉类及其制品蛋白质变化的有力工具[8]。

1 蛋白质组学技术

蛋白质组学作为后基因组时代的热门工具之一，其基本研究策略是先对蛋白或酶解肽段进行预分离富集，再通过质谱（mass spectrometry，MS）技术对关键蛋白或肽段进行分析鉴定。蛋白质组学的主要优点是在1 次分析中可以分离和定量数百种蛋白质，同时能进行单个蛋白质的详细表征、鉴定切割位点和蛋白质修饰，如蛋白质氧化和磷酸化[8]。蛋白质组学技术发展至今，其分离与鉴定技术不断被改进、创新，使蛋白质组学技术更高效、准确。

1.1 蛋白质的分离与鉴定

蛋白质的纯度会严重影响蛋白质的鉴定结果，因此蛋白质的高效分离成为蛋白质组学技术的重要基础。通常采用的预分离技术包括基于凝胶的方法（二维凝胶电泳（two dimensional gel electrophoresis，2-DE））和无凝胶方法（如毛细管电泳和多维色谱技术）[9-10]。若要使分离鉴定体系更简单，通常在样品预处理时引入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、等电聚焦或细胞器分离等手段[11]。蛋白质组学中最常引入的预分离技术为SDS-PAGE，但近年来，一种新型的等点聚焦预分离系统，即OFFGEL系统出现在蛋白质组学分析中。虽然OFFGEL系统存在分离时间长、所需样本量大等缺点，但其对肽段的分离具有高分辨率、高样品加载及灵活性等优点，可以作为现代蛋白质组学分析的可靠工具之一[12-13]。OFFGEL系统在医学领域中得到广泛应用，在肉类研究中应用较少，因此该技术在肉类研究中具有很大前景。MS技术通常用于对所得蛋白质的鉴定，为使鉴定结果更加准确，通常将多种鉴定技术结合使用。液相色谱-二级质谱联用（liquid chromatography-MS/MS，LC-MS/MS）技术以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-MS，MALDI-TOF-MS）在蛋白质分析鉴定中已被广泛应用。另外，以MS为基础的选择性反应监测/多反应监测（selected reaction monitoring/multiple reaction monitoring，SRM/MRM）技术已对肉类成熟和加工过程中发生的大量生化过程和蛋白质变化进行了部分阐明[14]。

1.2 蛋白质的定量

稳定同位素标记和非标记定量技术2 种定量方法已被应用于肉类研究[15-17]。其中，稳定同位素标记技术需要特定的软件、数据分析的专业知识以及昂贵的标记同位素，且对多种蛋白质的鉴定往往缺乏合适的标签[18-19]。同位素相对标记与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术是稳定同位素标记技术的一种，因其可用于鉴定和定量多个（最多8 个）不同蛋白质样品的丰度变化[20-22]而在近年来被广泛使用。Bjarnadóttir等[23]在牛肉嫩度研究中发现，采用iTRAQ和2-DE技术鉴定的蛋白质表现出类似的变化，这表明iTRAQ作为新的蛋白质定量技术在肉类品质变化研究中具有很大潜力。与稳定同位素标记技术相比，非标记定量技术对质谱仪和数据分析的要求较高，但其操作简单、成本较低，数据分析软件的不断发展也大大促进了该技术的应用。

2 蛋白质组学在肉类快速检测中的应用

随着生活水平的提高，消费者在肉类选择上更加倾向于高品质、安全的肉及肉制品。由于屠宰加工时肉的数量较多，对肉类品质的鉴定成为了难题。蛋白质组学作为一种先进的研究方法，通过对特定蛋白质（即生物标记物）的检测为肉类品质快速检测探索了一条方便、快捷的有效途径。

2.1 蛋白质组学在肉类品质鉴定中的应用

蛋白质组学旨在结合电泳和蛋白质测序技术阐明蛋白质的生物学功能，可用于鉴定预测肉类感官品质的分子标记物或生物标记物[24]。这些生物标记物是生物过程的量化指标，可能有助于增加对肉类品质变化的生化过程的理解[25]。滴水损失与嫩度可以作为判定肉类品质的标准。Pas等[26]运用蛋白质组学方法鉴定猪背最长肌的差异蛋白，结果表明，异柠檬酸脱氢酶、HSP27蛋白、肌球蛋白及超氧化物歧化酶可以作为滴水损失的生物标记物，其最大准确度稍高于80%，且蛋白质组合生物标记物明显比单一的蛋白质标记物具有更高的准确性。Wu Wei等[27]对贮藏期间中国鲁西黄牛2 种肌肉的肌浆蛋白质组进行分析，发现几种蛋白质与肉色属性密切相关，同时蛋白质的差异具有肌肉特异性，且在贮藏期间负责肉色稳定性，其中，甘油-3-磷酸脱氢酶、果糖-二磷酸醛缩酶A型异构体、糖原磷酸化酶、过氧化物酶-2、磷酸葡萄糖苷酶-1、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]及热休克同源蛋白（71 kDa）可以作为肉色的生物标记物，用来预测贮藏期间肌肉的颜色稳定性。Wiel等[28]确定出肌酸磷酸激酶M型、结蛋白和转录激活因子3 种蛋白质可以作为保水性的生物标记物，其中结蛋白也是与滴水损失有关的差异蛋白，结蛋白降解速率可能与肌原纤维收缩的持续时间和程度有关，因此结蛋白有可能同时作为滴水损失的生物标记物。如今，蛋白质组学技术对蛋白质功能研究的不断深入为明确1 种或1 组鉴定肉类品质的特定生物标记物提供了理论基础。通过对特定生物标记物的定量进行肉类品质鉴定将为人们对肉类的选择提供极大的方便。

2.2 蛋白质组学在肉类掺假鉴定中的应用

目前，肉类掺假的手段主要有以次充好及以假乱真。我国已有新闻报道，在肉制品销售中出现将廉价肉掺入高价肉中或将同种类的低质量肉（PSE（pale，soft and exudative）肉或DFD（dark，firm and dry）肉）掺入高质量肉中进行售卖，以获得高价利润的行为。虽然这些掺假行为被严厉打击，但仍有商家知法犯法，因此对于肉类掺假的快速检测必不可少。蛋白质组学方法是在酶联免疫法、聚合酶链式反应技术、近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIR）技术及色谱技术后出现的一种新的肉类掺假检测方法。Naveena等[29]利用OFFGEL系统结合MS技术对牛肉、水牛肉和羊肉的熟肉混合物进行鉴定，并与基于DNA的肉类物种鉴定方法进行比较，结果表明，新型蛋白质组学技术可以检测出低于0.5%的混合肉，基于DNA的检测方法可以检测出低于0.5%的生肉混合物和1.0%的熟肉混合物，表明蛋白质组学技术可以应用于肉制品中物种的检测，同时可以结合以DNA为基础的检测技术，探索出更快、更准确的肉类检测方法。Montowska等[30]对法兰克香肠进行组学分析，发现不同物种的蛋白质组具有差异，通过差异分析准确鉴定出鸡、猪和牛3 个物种，认为可以通过蛋白质组学方法对食物中特定的肽标记物进行定量及鉴定，以检验产品是否掺假。不同物种可以利用蛋白质组学技术进行检测，同样劣质肉与正常肉也存在差异。Desai[31]、Franco[32]等分别对PSE肉与正常肉、DFD肉与正常肉进行蛋白质组学分析，发现代谢酶类的表达使正常肉与劣质肉产生明显差异。许多研究证明不同物种、不同质量的肉类及肉制品的蛋白表达具有差异，因此运用蛋白质组学原理确定肉的特定蛋白，以此区分肉的组成是可行的。

2.3 蛋白质组学与多种组学相结合在生物标记物作用机制研究中的应用

在肉类的分析检测中，除了单独进行蛋白质组学分析外，还可以将蛋白质组学与多种组学技术结合进行高效研究[33]。Yang Hu等[34]采用综合分析方法对沙仔岭和约克夏猪的背最长肌进行蛋白质组学和转录组学分析，通过蛋白质组学鉴定得到23 种差异表达蛋白质，这些蛋白质可能参与了脂肪酸代谢、糖酵解途径和骨骼肌生长，并且明确了4 种基因编码蛋白（ENO1、ENO3、ATP5B和TPI1）参与糖酵解和脂肪沉积，同时又利用转录组学对ATP5B蛋白进行了克隆表达，结果表明，ATP5B蛋白可能在猪骨骼肌发育中起关键作用，更加深入地阐明了相关分子机制。François等[35]采用蛋白质组学与基因组学结合的方法对鸭肝脏蛋白质组数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）进行分析，证实了多个多效QTL与糖酵解和脂肪生成的代谢途径有关，并最终导致脂肪肝的形成，并且表示需要通过转录组学和代谢组学方法做进一步研究，以确定影响这些表型性状的生物标记物。转录组学和代谢组学可以作为蛋白质组学的补充研究，蛋白质组学、代谢组学和转录组学3 种研究方法相辅相成，共同构成了一个完整的生物机制研究系统，有利于今后的肉类品质研究。

3 蛋白质组学在肉类品质指标分析中的应用

3.1 肌内脂肪沉积

牛肉是人们比较喜爱的肉类之一，评价牛肉质量的方法之一就是评价其大理石花纹。大理石花纹是由肌内脂肪形成的，因此肌内脂肪（intermuscal fat，IMF）沉积成为影响牛肉食用品质的关键因素[36-37]。Romao等[38]的研究表明，蛋白质表达上调与下调的动态平衡共同调节脂肪组织的复杂生物学功能。Mao等[39]对不同脂肪含量的牛肉进行蛋白质组学分析，结果表明，HSPB1蛋白（一种热休克蛋白）的表达具有差异，这可能是由于HSPB1蛋白的低表达导致胰岛素抵抗，而胰岛素促进脂质的合成并抑制其降解，从而导致脂肪沉积，并且高水平的胰岛素也刺激MAPK途径[40]，导致更多的脂肪沉积。Poleti等[41]整合转录组辅助无标记定量蛋白质组学方法，研究背最长肌中的IMF沉积途径，结果表明，高IMF沉积组中存在的4 种糖酵解酶丰度较低，且肌动蛋白结合蛋白（ACTN1、ARPC2、SSH1及TTN）的表达明显下调，参与细胞脂质代谢过程的FAM135A蛋白和与细胞内信号、细胞骨架结构有关的PLEKHA5蛋白的表达上调，表明糖酵解代谢、肌动蛋白细胞骨架信号传导、细胞黏附连接、MAPK和胰岛素途径是影响IMF沉积的重要生物学机制。烯醇酶3作为糖酵解关键酶，其许多亚型已被证实对于猪的IMF沉积具有影响[42-43]。通过蛋白质组学技术对不同脂肪沉积的肌肉进行分析发现，大多影响IMF沉积的蛋白质均会直接或间接调节重要的生物途径，通过对差异蛋白的作用机理进行研究，可以为改善肉质提供基础，并为确定脂肪沉积的生物标记物提供依据。

3.2 嫩度

嫩度是肉类品质评价的另一重要指标，蛋白质组学的出现使得人们可以通过整体评估肌肉蛋白质或其组成更加深入地了解影响肉类嫩度的生物化学机制。Kiran等[44]对水牛的2 种肌肉进行分析，结果表明，2 种肌肉的嫩度具有差异；随后对2 种肌肉进行蛋白质组学分析，鉴定到3 种蛋白质（钙转运ATP酶2C型、钙/钙调蛋白依赖性3’,5’-环核苷酸磷酸二酯酶1B和热休克蛋白β-1）的差异表达，表明这3 种蛋白质与肉的嫩度具有一定相关性。其中热休克蛋白是一个非常特别的蛋白质，是导致肉类嫩度差异的关键蛋白质，其作用机理可能是热休克蛋白表达下调加速了肌动蛋白解体或降解，从而改善了肉的嫩度[45-46]。许多研究均证明热休克蛋白可以作为肉类嫩度的生物标记物，其他可作为生物标记物的蛋白质多为糖酵解酶和参与结构形成的蛋白质，如肌钙蛋白[47]。Beldarrain等[48]利用OFFGEL结合MS技术对不同嫩度的肉进行分析，发现7 种蛋白质（肌钙蛋白T、热休克蛋白β-1、肌酸激酶、肌动蛋白、肌钙蛋白C、肌球蛋白1/2）存在表达差异，肌球蛋白1作为肉质嫩度的标志物未被报道过，其他差异蛋白均有文献曾指出可作为嫩度评价的生物标志物。此外，李婕等[49]发现，热休克蛋白与肉的保水性和嫩化作用密切相关，但其是否可以作为鉴定全部肉类品质的标准仍需大量研究。

3.3 肉色

蛋白质组学技术的创新应用揭示了肉色变化的生物基础，指出许多内源性和外源性因素均影响家畜和家禽的肉色，并且肉色具有物种特异性和肌肉特异性[50]。肌红蛋白是负责肉类红色的主要色素，其变化取决于肌红蛋白及其3 种氧化还原形式（脱氧肌红蛋白（deoxymyoglobin，DeoMb）、氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）和高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MetMb））的浓度，肌红蛋白的化学性质及其与其他生物分子的相互作用影响宰后骨骼肌的颜色稳定性[51]。Wu Wei等[52]结合蛋白质组学技术对鲁西黄牛贮藏期间的肉色变化进行研究，结果表明：在贮藏第0天和第5天、第10天和第15天，牛肉的表面红度值随着贮藏时间的增加呈现明显的下降趋势，并且MetMb含量急剧上升，并伴随着OxyMb含量的下降，因此MetMb的积累可能是造成肉色呈暗褐色的原因；同时，参与糖酵解代谢和氧化还原过程的代表性蛋白质丙糖磷酸异构酶、L-乳酸脱氢酶A链异构体、果糖二磷酸醛缩酶A型异构体、过氧化物氧还蛋白-6和丙酮酸激酶同工酶M1/M2异构体的表达量发生明显变化，这些蛋白质均可以通过影响生物体代谢来影响肌红蛋白含量，表明这几种蛋白质的表达与肉色变化有关，可以作为监测肉色变化的候选预测因子。Canto等[53]对包装后牛肉背最长肌的肌浆蛋白质组进行研究，结果表明，在贮藏第0天和第11天时，9 种蛋白质在牛排中的表达量差异性很大，其中3 种糖酵解酶（葡萄糖磷酸变位酶-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶M2）在变色牛排中过度丰富，与红色和颜色稳定性呈正相关，其原因可能是颜色稳定的牛排中过多的糖酵解酶有助于肌肉中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（nicotinamide adenine dinucleotide hydrate，NADH）的再生，从而提高颜色稳定性，而颜色不稳定牛排中的肌红蛋白原位翻译后修饰损害了颜色稳定性，这些结果说明上述3 种蛋白质与牛肉颜色变化显著相关。肉色是肉类加工处理过程中最重要的特征之一，而肌红蛋白在维持肉色中起到重要作用。因此，可以利用蛋白质组学技术对影响肌红蛋白变化的蛋白质进行研究，寻找预防肉色改变的方法。

4 结 语

通过蛋白质组学分析鉴定差异蛋白，为快速鉴定肉品质提供了准确、高效的途径，同时蛋白质组学技术与其他组学技术的结合使用为更加深入地了解肉制品品质变化的生物化学机制提供了有效途径。近年来，众多研究发现热休克蛋白是非常特殊的蛋白，其与肉的嫩度、IMF沉积、滴水损失及肉色均存在极大相关性，因此热休克蛋白极有可能成为肉品质检测中快速且有效的标记性蛋白。然而，蛋白质组学发展至今不到30 年，其在肉类研究中的应用并不完全，仍然具有很大的应用前景。蛋白质组学技术应用方法的不断创新将会为科学研究的进一步发展做出更大的贡献。