中国乙型脑炎病毒株的毒力变异和减毒活疫苗的研究

俞永新

100050北京,中国食品药品检定研究院

自1949年以来，中国学者从自然界分离到数百株乙型脑炎病毒株并对其进行过病毒的生物学特性、致病性、抗原性、毒力变异和疫苗的研究[1-6]，积累了大量的宝贵资料，为阐明乙脑在自然界的流行规律和对乙脑的防控、疫苗研制等提供重要科学数据，其中特别是对自然界乙脑分离株间的神经毒力差异及其机制，以及实验室内毒株的毒力变异和减毒活疫苗的系统研究，获得突出的成绩，达到国际领先水平。

1 中国乙脑病毒分离株的毒力研究

20世纪50年代，黄祯祥等[7]在北京从乙脑患者、蚊虫、猪血分离到共53株乙脑病毒，并对这些分离株进行3周龄小鼠的脑内和皮下毒力的比较。结果显示所有的毒株对小鼠的脑内毒力相差不大，LD50滴度(对数)一般都在7.5～9.0之间，但发现不同来源毒株都存在皮下毒力高低不同的毒株，皮下毒力高者达6.1～8.1 lgLD50，低者只有1.0～3.0 lgLD50。若以脑内和皮下LD50滴度(对数)差值＜3.0(高皮下毒力)计算，则从人体分离的23株中有8株(8/23)、蚊体分离的12株中只有2株(2/12)、从猪体分离的20株中最少只有3株(3/20)。提示自然界确实存在皮下毒力高低不同的乙脑毒株，其中从乙脑死亡病例中分离的高毒力株居多。可能皮下毒力强的病毒容易通过大脑屏障侵入脑内有关。王逸民等[8]进一步研究不同年代不同来源10株病毒的致病性，结果也显示毒株间存在明显的皮下毒力差异。毒力高者脑内/皮下的LD50差值仅为1.0～1.5 lg，低者为4.33 lg，毒力高者，空斑形态普遍较大，但不同时期的分离株未见差异。

李河民等[9]比较4株乙脑病毒脑内和皮下致病性，发现病毒的脑内毒力无明显差别，LD50滴度(对数)为8.0～8.4，但皮下毒力有很大差别，P3和P1株LD50滴度(对数)分别＞5.0和5.17，而47株和广谭株均＜0.75。黄祯祥等[10]曾对P1株和中山(Nak)株的感染力进行比较，分别以不同途径接种3周龄小白鼠，结果P1株不同代次脑内感染的LD50滴度(对数)平均为8.6，Nak株平均8.2，二者无明显差别。但两株病毒皮下接种感染的结果差别很大，P1株LD50滴度(对数)平均值为7.6，而Nak株平均值滴度＜1.3，表明二者皮下致病力有显著差别。

近年来，刘欣玉等[11]对国内分离的毒株和以往的分离株共17株进行小鼠(12～14 g)脑内和皮下的毒力比较，结果也发现毒株间脑内毒力无明显差别，但毒株间皮下毒力差异明显。毒力低的毒株如HLJ02-144株，其 LD50滴度(对数)仅为4.30；而毒力强的毒株如02-41株，滴度高达7.67，但毒力在两种基因型间无差别。分析毒株的毒力和毒株来源的关系，可见从患者分离的6株中4株的毒力为高和中等水平，结果与黄祯祥等早期的报告一致。说明人分离株的毒力普遍较强，其原因可能是自然界侵入人脑而致病的病毒一般毒力较强。分离自黑龙江省的毒株共有3株，其毒力均在中等和低水平，其原因可能是由于黑龙江气温较低，病毒在蚊体内和动物宿主内的复制周期短，病毒变异机率少有关，还有待进一步研究。

乙脑毒株间的脑内毒力差异虽较少发现，但亦曾有报告。黄祯祥等[12]从三带喙库蚊分离到31株乙脑病毒，用3周龄小鼠比较其脑内毒力，发现病毒滴度TCID50/LD50存在差异，有5株毒力低的毒株，其中2株比值为3.17 lg，3株为2.17～3.0 lg；其余26株毒力较高的毒株，其比值＜2.0，表明毒株间脑内毒力亦存在一定差异。

陈伯权等[13]对印尼分离的5株乙脑病毒进行小白鼠的脑内和皮下毒力实验，发现脑内毒力明显差异，毒力高者病毒滴度PFU/LD50比值仅为0.83，低者为3.23。将低毒力病毒株进行空斑克隆，在10个空斑中出现4个空斑病毒的PFU/LD50＞5.00，对低毒力的病毒又进行第2次空斑克隆，结果出现3株以6.0 lg PFU病毒接种3周龄小鼠脑内不致死的病毒。

近年在中国台湾1个小岛上从骚扰阿蚊中分离到1株对乳鼠脑内致病力很弱的TIPI株，其LD50为2.44×106PFU较分离自其他地区的CH1 392株毒力(2.87×102PFU)明显较低。而该岛上居民的乙脑抗体阳性率虽然较高(48.8%)，且抗体水平随年龄增长而升高，但该岛多年未发现临床乙脑病例[14]。分析其原因可能是由于弱毒株不引起临床表现，但可以产生隐性感染。SA4株其脑内毒力(LD50)虽与其他乙脑毒株相似，但小鼠脑内接种后，病毒在脑内的增殖速度较其他毒株显著迅速，引起动物发病和死亡的时间更快，呈暴发型，与其他毒株比较死亡时间要提前约24 h，同时脑内病毒滴度的高峰也提前1 d[15].

以上结果表明自然界确实存在脑内和皮下毒力高低的乙脑病毒株，该结果可以解释人类受感染后有轻重不同临床表现及显性和隐性感染的主要原因。

黄祯祥等[16]对神经外毒力差异的机制进行研究，发现毒力高的毒株在小鼠体内产生的病毒血症持久时间长，如高皮下毒力的P1株，时间长达6 d，而低毒力的M47和Nak株，病毒血症时间仅为2 d。而且在体外实验显示，皮下毒力高的毒株对温度的稳定性亦较高。将P1和Nak株病毒液置37℃水浴内，Nak株56 h检测阴性，而P1株置72 h仍可测出1.62 lg病毒。汪瑾等[17]还观察到不同毒力病毒株在小鼠体内不同脏器如肝、脾、心，肾等的繁殖能力相差很大，如P1株的繁殖力强，脏器内病毒滴度普遍高于Nak株，存在的时间亦较长。病毒侵入脑内的时间早，如以小剂量病毒静脉注射则各脏器内的病毒量，A2株普遍较高，NaK株则测不出病毒。

黄祯祥[18]将皮下毒力强的京卫研1(A2)在不同鼠龄以不同途径传代的毒力变异研究，结果显示在鼠脑传代过程中，皮下毒力随着传代次数的递增而下降，降低的速度又与传代用小鼠的鼠龄密切关系。即鼠龄越大，脑内传代后皮下毒力下降越快，下降幅度越大。如将A2株在7日龄、3周、5周和1年龄小鼠的脑内传代时，经7日乳鼠脑内传代的病毒到145代时，才可见毒力明显下降，在3周小鼠脑内传代的病毒，到113代后，皮下毒力已下降到4.5lg LD50，在5周鼠脑内传代时到113代后皮下毒力已下降至1.0～1.3lg LD50，而在1年鼠脑内传代的毒力到118代时已失去其皮下毒力。但是如病毒通过小鼠皮下接种传代，皮下毒力不降低。另外将鼠脑内传代后皮下毒力降低的变异株，通过同龄小鼠皮下传代，皮下毒力可以回转增强。如皮下毒力降低为2.7lg LD50的变异株，通过皮下传代115代后皮下毒力又增强至7.1lg LD50.

以上结果显示病毒变异是通过适应过程来实现的，一方面与原来病毒的特性有关，另一面则取决于环境，环境越不同于病毒原来的生存条件，病毒发生变异的时间就越快，幅度越大。

2 中国乙脑减毒活疫苗的研究

20世纪50年代开始，中国病毒学研究人员不断探索研究乙脑的减毒活疫苗，取得重大的成果，其中1株SA14-14-2株已得到WHO和国际公认，是1株高度减毒安全长效的疫苗株，另一些毒株虽然没有获得生产许可证，但在病毒毒力减弱、免疫原性提高技术和规律上积累了丰富的经验，对乙脑和其他黄病毒减毒活疫苗的研究具有十分有益的参考价值。

2.1 鸡胚细胞传代减毒株

2.1.1 鸡胚细胞连续传代后的毒力变异:李河民等[19]将乙脑P3株在鸡胚组织块细胞37℃培养连续传代，随着传代代次的增加，对小鼠的皮下毒力逐步下降，对10～12 g小鼠已失去致病力，对乳鼠的毒力也降至3.0 1 g。但脑内毒力未见降低，在129代时脑内毒力仍高达4.5～5.5 lg，继续传至230代，同时另1组自138代置41℃培养119代共计257代，结果脑内毒力均未见降低。

以后又另选SA4(1952年由汪美先在西安乙脑病例分离株)和Lm株(1956年由俞永新在北京市从乙脑患者脑分离出)在相同的体外鸡胚组织块细胞培养内传代[20]，结果Lm株在37℃传至189代。王用楫等[21]用P3株乙脑病毒在鸡胚细胞连续传140代获得一株C系减毒株，其对7～9 g小白鼠腹腔毒力明显降低，由第1代的4.8 lg LD50下降至以病毒原液接种时仅个别小鼠发病死亡(≤10%)。脑内的毒力也有一定下降，但不明显，由第1代的5.8 lg LD50下降至2.5～4.0 lg之间。以C株第24、57、119代活毒免疫小鼠1剂，免后14 d以活毒腹腔攻击，结果保护指数高达百万以上，免疫组小鼠仅在攻击后2或3 d在局部和对侧淋巴腺和血液查到病毒而对照组小鼠，则于1～6 d内在淋巴腺、血液、肝、脾和脑等组织广泛存在病毒。表明该减毒株具有良好的免疫原性。

王用楫等[22]进一步以C株对仔猪进行免疫观察以1.0和10 ml分别接种6只仔猪，抗体阳转率分别为2/6和5/6。

2.1.2 鸡胚细胞传代加乳鼠皮下传代减毒株[23]:上述SA4株鸡胚细胞传代后的皮下毒力完全丧失，脑内毒力仅有一定的下降但免疫原性很差。为提高其免疫性，将SA4鸡胚细胞203代病毒在1～3日龄乳鼠皮下传代，接种病毒后4 d，收取局部皮肤和皮下组织及淋巴结混合研磨后，以10-1悬液接种鸡胚细胞培养增殖病毒后，再以同法接种乳鼠皮下，交替传代至12代后，单在乳鼠皮下连传3代，共计15代，获得毒株命名为SA4SM株。对SA4SM株毒力和免疫力进行研究，发现SA4SM株脑内毒力较未经乳鼠皮下传代的病毒毒力约下降2.0 lg。将SA4SM株做空斑克隆纯化，结果，5个空斑中有4个对小鼠的脑内不致病或个别致死，仅1个空斑病毒的毒力为2.0 lg。而未经乳鼠皮下传代的病毒5个空斑中的脑内毒力高达2.0～4.0 lg。

为考核实验的可重复性，又将SA4 CEC279代病毒按同法，在乳鼠皮下传6代。结果从第1代开始各代病毒均较原始株毒力下降1.0～2.0 lg。但有趣的是，虽然第1代和6代病毒的毒力无明显差别，但经空斑克隆后，则发现在相同病毒感染量的情况下，第6代中，9个空斑病毒普遍较低，LD50在0.61～1.78 lg，而第1代中的7个空斑病毒毒力明显较高，为2.0～3.37 lg。以上结果提示病毒可以通过乳鼠皮下传代快速减毒，其机理可能与病毒在非神经组织内的选择适应，淘汰嗜神经病毒颗粒有关。

为进一步筛选到毒力更低特别是对小鼠脑内无致病性的减毒株，作者又对SA4SM株进行连续6次的空斑筛选，每次选毒力最低的空斑病毒作为代表株进行下一轮纯化，结果在前5轮的纯化中，数十株空斑病毒的脑内毒力，普遍较低，但病毒原液对小鼠仍有半数死亡或仅死亡1只，未达到对小鼠脑内完全不致病的程度。因此又进行第6次空斑纯化，结果8个空斑中只有2个对小鼠死亡1只，其余6个均对小鼠均不致病。为了解这8个空斑的毒力稳定性，进行了小鼠脑内回传实验(返祖实验)，结果一个空斑病毒经脑内传至第3代毒力仍为0，第4代时略有回升，≥2.5 lg LD50；另一个空斑传至第4代毒力为0，到第5代，PFU为5.69 lg，LD50仍低至1.0 lg LD50，表明这株病毒不但对小鼠脑内无致病性，而且毒力十分稳定，无返祖现象，达到制备减毒活疫苗的低毒力和遗传稳定性的稳定水平。

作者进一步对乳鼠皮下传代后病毒及其克隆株的免疫性进行研究，结果显示通过乳鼠皮下传代后的病毒株，免疫原性有极大的提高，免疫保护指数提高万倍，如传代前的原始株CEC279代病毒的保护指数为＜10，而SA4SM株为1万，其空斑纯化克隆株的免疫指数亦高达万至10万，其中高度减毒株SA4SM-6克隆株的指数为13万[23]。

以上结果显示通过乳鼠皮下传代不但病毒的神经毒力极大下降，而且免疫原性也极大提高，原因应该是病毒提高了在机体皮下和周围淋巴组织的复制和繁殖能力，促进机体免疫系统对病毒抗原的应答。

2.2 地鼠肾细胞传代减毒株 以地鼠肾细胞传代为主并结合其他手段对乙脑病毒进行毒力减弱的减毒株有以下数株。

2.2.1 SA14-14-2株[24-25]

2.2.1.1 减毒历史:通过不同乙脑病毒分离株的生物学特征、抗原性和免疫原性的研究比较后选用1954年由汪美先分离自西安库蚊幼虫的SA14株鼠脑11代病毒作为母株进行减毒，采用地鼠肾细胞连续传代技术，但不是传统的低温(32℃ ～34℃)培养，而采用36℃ ～37℃下培养，经地鼠肾细胞培养传100代后，病毒对10～12 g幼鼠的脑内毒力由原来的8.0 lg下降至3.7 lg/0.03 ml[26]，经蚀斑克隆后，从9株毒力不同(LD50＜0.0～5.50 lg)的空斑病毒中，选出1株对小鼠脑内注射仅个别发病的弱毒克隆株(12号)，对12号病毒进行空斑2次克隆获得1株脑内毒力仅对个别小鼠发病的12-1-7株[27]。

但12-1-7株的弱毒很不稳定，经细胞传数代或小鼠脑内传1代，毒力迅速回升恢复至接近其母株SA14的毒力水平，以后虽经2次的空斑克隆纯化，但仍未能筛选到弱毒稳定不返祖的弱毒株。随后，进行第二步减毒，采取一种具有一定创新性的手段，即通过动物非神经组织传代与空斑克隆相结合的技术，将12-1-7株病毒在小鼠腹腔传一代取脾，空斑克隆4次，再经小鼠皮下传1次，取皮下组织，空斑克隆1次，获得1株弱毒高度稳定的毒株，即病毒经3周龄小鼠脑内连续传5代，或经乳鼠脑内传1代，鼠脑内的病毒毒力为0的结果，命名为SA14-9-7株[28]。但该株病毒制成活疫苗，经儿童接种后抗体应答很差，在41名儿童中只有1名的中和抗体阳转，7名由阴性转为可疑[29]。

为提高SA14-9-7株的免疫性，又将病毒通过动物体内免疫器官(脾脏)传代的技术。将SA14-9-7株通过口服途经接种地鼠，收脾脏再以同法连续传6代，最后经空斑克隆2次，获得1株毒力和弱毒稳定性与SA14-9-7株相同，而免疫原性(小鼠免疫后的保护力和免疫后中和抗体水平)显著提高的病毒株，命名为SA14-5-3株[29]。

SA14-5-3的人体免疫后抗体应答观察结果，显示其免疫性有显著提高，如山东济南的结果阳转率为86.2%(25/29)[29]，在其他乙脑流行区为85% ～92%[30]，但在非乙脑地方病区如浙江象山县坛头山岛的阳转率仅为55% ～77.6%[31]，黑龙江齐齐哈尔市仅为62%[32]。表明其免疫性仍有待提高。另外SA14-5-3株在猪体内进行过大量安全性和免疫性观察表明对猪的免疫是安全的，并有预防猪感染乙脑引起流产和死胎的免疫效果。弱毒株稳定不易返祖如通过乳猪皮下传5代后，其血清、脾脏和皮下组织内的病毒，对小鼠脑内接种仍无致病性[33]。SA14-5-3株虽然没有应用于疫苗的生产，但其大量的人体安全性免疫性观察为以后SA14-14-2株提供临床应用依据。

为进一步提高SA14-5-3株的免疫性，又采用上述相似的技术，但传代途经改为前述乳鼠皮下传代的方法，最后筛选到1株毒力最低，免疫力最高的第14-2号空斑病毒，命名为SA14-14-2作为疫苗制备用候选株[34]。以上从SA14-9-3株开始至SA14-14-2株共计通过14次空斑克隆，从100多个病毒空斑中筛选而获得，筛选过程中基本根据以下三项指标:1.对2.5周龄小白鼠脑内接种不致病，脑组织病理变化显著减弱，仅个别神经细胞坏死。2.幼鼠或乳鼠脑内传代1～3代后，毒力无返强。3.以免疫动物1针后诱生中和抗体(＞10)并对乙脑野毒株共攻击具有显著保护力(90%以上)。

乙脑病毒是嗜神经毒力很强的病毒，以10-7很小剂量病毒液脑内接种小鼠或猴就能引起动物发生脑炎死亡，要把乙脑病毒毒力减弱至对以上动物脑内接种不致病其难度极大。20世纪50～60年代美国、日本、前苏联曾进行过多年的研究，但均未能达到这种水平，特别是要达到减毒株病毒通过乙脑病毒敏感动物脑内返回传代，而毒力未回升返祖则更难。SA14-14-2疫苗的成功经验，是早期采用与传统(32℃ ～34℃)不同的常温(37℃)下培养细胞传代减毒，当弱毒毒力容易恢复返祖时采用与传统(体外细胞长期传代)不同的体外细胞培养与体内非神经组织交替传代减毒的手段，并在毒力减弱而免疫性降低后采用体内免疫组织内传代增加弱毒繁殖能力提高免疫应答的手段。同时在减毒过程中不断进行多次的空斑克隆筛选。特别是发现弱毒在体内免疫组织传代有进一步降低毒力，提高弱毒稳定性的作用，以上SA14-14-2株的减毒成功经验具有独特的创新性。

2.2.1.2 SA14-14-2株的表型和基因分子特征[35-36]:病毒对2.5周龄小鼠脑内、皮下、腹腔接种均无致病性，对地鼠、恒河猴脑内接种或裸鼠皮下接种均无致病性。弱毒稳定，经3周龄小鼠脑内传5代或乳鼠脑内1代，弱毒稳定未返祖[37-38]。

对SA14-14-2弱毒株的基因分析表明，强毒株SA14和减毒株SA14-14-2基因组长度均为10 976个核苷酸，两者存在57～66个核苷酸差异，导致24～31个氨基酸发生改变。其中以外膜蛋白E区氨基酸突变率最高，有8个氨基酸发生突变，经实验证实该突变与毒力减弱密切相关[39-40]。以后通过乳鼠脑内传1～3代后进行传代前后的病毒全基因序列分析比较，发现E区的E107和E138氨基酸与毒力减弱最为密切，这2个位点氨基酸恢复突变，则神经毒力很快回升[41]。证实SA14-14-2株的遗传稳定性很高，通过乳鼠脑内传1代其病毒的基因全序列和弱毒特征未发生回复突变[41]，实验表明在地鼠肾细胞传22代的晚代病毒与原始病毒的全长核苷酸仅发生8处变化，导致4处氨基酸改变，但均非回复突变，其核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.30%和99.88%，其中E区8个关键氨基酸均未发生突变[42]。另外，将病毒经乙脑病毒主要媒介三带喙库蚊和致倦库蚊口腔感染，病毒在蚊体内复制受限，如经胸腔感染，则病毒虽然复制，但复制能力较SA14母株低，子代病毒对小鼠脑内仍无致病性，E区8个重要氨基酸未发生突变，表明减毒株病毒无通过蚊虫传播的能力[43-45]。

对病毒的免疫原性研究发现，SA14-14-2株病毒免疫后的一些动物虽然中和抗体很低或阴性，但对野毒株的攻击保护很强，与灭活疫苗明显不同[46]。进一步研究发现，其与SA14-14-2免疫动物后产生很强的细胞免疫应答和非结构蛋白中NS1的免疫作用有关[47-49]。SA14-14-2株疫苗产生较强的T细胞免疫应答，最近也在人体观察中得到证实[50-51]，并且发现疫苗免疫后产生的T细胞免疫应答对登革热病毒有交叉反应，提示有可能研发1种对乙脑和登革热两种疾病均有效的新一代疫苗[50]。另外SA14-14-2株疫苗免疫小鼠后对当前国内流行的Ⅰ、III型基因病毒均有显著保护(80% ～100%)[52]。

2.2.1.3 SA14-14-2株临床安全性和免疫性

SA14-14-2株制备的活疫苗在齐齐哈尔市非乙脑流行区进行小量人体观察并与SA14-5-3株对比，结果前者的抗体阳转率为92.3%，后者为61.5%[32]，以后又在张家口市进行观察，结果抗体阳转率为100%[53]，证实了SA14-14-2株的高免疫原性，优于SA14-5-3株。疫苗又经50万的临床观察[54]，证明安全有效后，取得生产文号，由成都生物制品研究所正式投产。

上市后的疫苗在国内外进行多次大量的安全性和免疫观察，表明疫苗十分安全，未发生与疫苗病毒引起的脑炎病例，中和抗体的阳转率在91% ～95%[55]，保护效果93% ～94.5%[56-57]，持久性在国内观察结果至少11年[58]，在国外观察结果至少5年[59]。已得到国际普遍认可，是一种高度安全有效的新一代疫苗。

尼泊尔2004—2014年疫苗大规模应用的10年效果观察显示，免疫后10年较免疫前当地乙脑减少3 011例，急性脑炎综合症减少9 497例[60]。美国学者对SA14-14-2株疫苗于1995年和2015年间，在亚洲不同国家的16次临床资料总结进行了综合回顾，得出的结论是，自1988年以来已在全球发出了7亿剂SA14-14-2疫苗，乙脑减毒活疫苗对大范围年龄人群均有良好的耐受性，并且在八周婴儿接种也是安全的，根据现在资料，独立专家(independent expert)们并没有发现接种乙脑活疫苗后报告的严重不良反应与疫苗有关的足够证据[61]。疫苗在全球大规模应用后没有发生与疫苗有关的确实证据也得到WHO认可[62-63]。

目前疫苗在国内已纳入扩大免疫规划用制品广泛应用，2013年由成都生物制品研究所有限责任公司生产的乙脑活疫苗为我国首个疫苗产品通过WHO预认证[64]，在美国适宜卫生科技组织(PATH)和GAVI联盟的支持下已大量出口到国外应用，目前已有尼泊尔、印度等10多国进口该疫苗[65]，年出口量约5千万人份。

此外，SA14-14-2株也在中国农业农村部所属多个生物药业公司用于制备猪乙型脑炎活疫苗，在国内广泛应用于预防猪感染乙脑病毒引起的流产、死胎和睾丸炎[66]。

2.2.2 SA14-2-8株[67]:2-8株对乳鼠的脑内致死力平均75%，对3周龄小鼠脑内毒力仅个别发病致死。但2-8株的免疫原性有很大提高，保护指数高达7.33lg，并对豚鼠、家兔、地鼠免疫后产生较高的中和抗体。2-8株经16只的猴体实验，脑内注射后只有6只发生很低的发烧，病理变化所有猴均有不同程度的炎症反应，神经细胞坏死虽轻，但4/16-9/16猴在不同部位有病变。疫苗曾接种过8 000名儿童，但抗体阳转率仅约50%，未继续进行临床研究。但2-8株疫苗在马匹体内进行过安全性的免疫性观察[68]。皮下或肌内注射465匹马，未见体温反应及任何神经系统病状。中和抗体阳转率84.9～86.6%，免疫后对马匹乙脑感染的保护作用，在重流行区进行过观察，疫苗注射组13 246匹，发病4匹，发病率30.2/10万；未注射组(对照组)10 081匹，发病32匹，发病率317.4/10万，保护率为90.49%[68]。

2.2.3 H84SP12和L51P11株:林海祥等[69]用空斑克隆技术，以3周龄小鼠皮下毒力(LD50)高低为筛选指标，直接从SA14株乙脑病毒中。通过3次克隆纯化，分离到1株皮下低毒力(LD502.67lg)病毒株，称L株和1株皮下高毒力(LD50，6.5lg)株，称H株。2株病毒在小鼠的皮下繁殖力H株显著高于L株。

将2株病毒分别以快速(18 h)传代法在地鼠肾细胞培养内连续传代，结果病毒对幼鼠的皮下毒力，L株下降很快，脑内毒力亦有一定下降，但不够显著，与传代前病毒的毒力比较约下降2.0～3.0lg LD50。为进一步减毒和提高免疫性，将H株84代病毒按上述SA14-5-3株的乳鼠皮下传代法传1代(H84S1)，结果病毒的脑内毒力显示进一步减弱，细胞和LD50的滴度差值为3.5lg，大于传代前的1.17差值。

用L51代病毒以小鼠脑内低毒力为指标，通过空斑连续纯化7次，各次病毒空斑均出现高低不同的空斑病毒。但逐次出现低毒力病毒比例占多数的倾向，最后获得的弱毒株命名为L51P11。同法将H84S1株通过空斑连续克隆挑选8次，同样出现随着空斑次数的增多，低毒力病毒出现的比例增多的倾向，最后在第8次病毒空斑中挑选到一株脑内仅个别小鼠致死的空斑病毒，又经过4次空斑纯化后，将该弱毒株命名为H84SP12。2株病毒的免疫性继续了3次重复实验比较，实验均显示H84SP12株的保护力强于LI51P11株，即前者保护50%小鼠存活的最小免疫剂量小于后者100倍以上。表明H84SP12株虽然脑内毒力与L51P11株相似，但免疫性明显优于后者，提示预先筛选皮下毒力高，繁殖力强的病毒株，以及再通过乳鼠皮下传代提高病毒在体内的繁殖力，有助于及时选育到毒力低免疫力强的减毒株，避免在传统的传代减毒过程中经常遇到的毒力减弱后免疫性也减弱或丢失的缺陷，有其独特的创新技术。另外本研究中快速的传代减毒技术亦具有一定的创新性。

2.2.4 鸡5-3株:王用揖等[70]用以上述SA14-5-3减毒株为毒种，经鸡胚细胞和地鼠肾细胞交替传代3次后，在鸡胚细胞培养上空斑克隆1次，再经鸡胚卵黄囊接种，取胚传下代，连续传25代，病毒滴度达6.0lg TCID50。以25代后的鸡胚病毒制成冻干疫苗进行马匹免疫实验。马匹于颈部肌内注射2.0 ml疫苗，免疫后1个月内，未见体温上升亦无不良反应，接种后5～7 d产生病毒血症，中和抗体阳转率免后1个月73.6%(强阳转率)和94.7%(弱阳转率)。疫苗免疫马匹后，用乙脑强毒株感染攻击，结果未免疫马经强毒株攻击后出现临床症状和病毒血症，免疫马未出现症状和病毒血症，表明鸡5-3株具有保护乙脑野毒株感染的保护作用。

2.2.5 SA14-14-2:PCK株[71]:中国食品药品检定研究院与美国泛特里军事医学研究所WRAIR合作，将乙脑SA14-14-2减毒株早代病毒在原代狗肾细胞(液氮冻存的细胞)连续传代，病毒滴度在第6代时达高峰(7.0×106lg PFU/ml)。继续传至16代滴度未继续升高，用第7、8、9代病毒分别制成主毒株，生产毒种和疫苗，各代病毒均对2～3周龄ICR小鼠脑内接种无致病性，以生产毒种病毒接种10只恒河猴和SA14母株2只猴对比作神经毒力实验，每只猴于脊髓和大脑两侧各接种1剂量病毒液或稀释液，结果生产毒种组和稀释液组猴均未出现神经症状，SA14 2只均出现上下肢麻痹症状。病理变化分三级判定，结果生产种猴的病理未出现神经细胞坏死，均为V1级的轻度病变，而SA14乙脑强毒株病毒则出现神经细胞退变和坏死，V2占绝大多数，少数为V1和V3级。

后期WRAIR将毒种转让Intercel Biomedical用Vero细胞生产灭活的乙脑疫苗，已经美国批准临床应用，并已在全球很多国家推广应用[72]。

2.2.6 SA14-14-2PDK-CD株:王寿贵等[73]将SA14-14-2株第5代毒种适应小狮子狗胎肾原代细胞(PDK)。发现病毒能很快适应PDK细胞，从第4代至11代病毒滴度稳定在7.5～8.0 lg TCID50，并对12-14 g小鼠脑内接种均无致死，通过乳鼠脑回传一代后对幼鼠的脑内毒力仍很低，在0.5～1.67 lg LD50。表明其毒力高度减弱而且稳定不易返祖。

以SA14-14-2PDK-CD株制备的活疫苗在甘肃省武威市非乙脑流行区进行儿童和成人接种观察，同时与SA14-14-2 HK株活苗进行比较[74]。结果两组疫苗接种者均未发现疫苗引起的不良反应。23名接种前抗体阴性儿童接种1针后的抗体阳转率为92.9%，25名抗体阴性儿童接种SA14-14-2 HK株的95.7%相似。显示SA14-14-2 PDK-CD株的毒力低稳定而且有良好的免疫原性，具有发展1种以原代狗肾细胞为基质生产的乙脑减毒活疫苗的前景。

3 结语

1949年初期，中国乙脑严重流行，年死亡人数高达数万至10多万。老一辈科学家包括黄祯祥、汪美先、王逸民、李河民、王用揖、自登云等从自然界分离到数百株乙脑病毒，进行生物学、抗原性、免疫性以及细胞培养特征和毒力变异的研究，发现自然界乙脑毒株间存在毒力的明显差异，特别是神经外毒力差异更为显著，并且发现同一病毒株内存在不同毒力的病毒颗粒，通过空斑纯化能够加以分离，经实验室研究发现毒力强弱与病毒在体内各脏器的复制强度、持续时间和病毒血症有关。另外通过动物和细胞的培养传代可以人工诱导病毒的毒力变异。结合乙脑在自然界的流行和传播规律的研究阐明毒力变异的原因取决于环境的压力，即与媒介昆虫、动物宿主和自然环境等因素密切相关。同时也阐明人体乙脑隐性和显性感染的原因。研究结果为以后中国乙脑的防控以及灭活疫苗和减毒疫苗的研制和实际应用提供重要的科学数据。

在病毒的毒力变异、减毒和减毒活疫苗研究上，中国学者作了大量的研究工作，获得多株减毒株，已成功制成疫苗应用人体、猪体和马匹，对我国在人和动物中乙脑流行的控制起到重要作用。虽然一些减毒株未能达到制备人体减毒活疫苗的质量标准，但在病毒的培养特征、变异规律、减毒技术、减毒指标和检测技术及质量控制上取得值得借鉴的丰富经验。其中特别是发现病毒通过实验动物体内的非神经组织传代，能够进一步降低病毒的残余毒力并提高其免疫性，应用该创新性技术成功筛选到1株高度减毒而稳定并保持高免疫性的SA14-14-2株。用其制成的减毒活疫苗，达到国际领先水平，得到WHO的认可，生产的疫苗取得了WHO的预认证，已在国内外广泛应用。将对全球的乙脑控制，降低死亡和残疾人数起到重要作用。美国疾病预防控制中心专家们指出[76]，当前有几种乙脑疫苗可供选择，特别是乙脑SA14-14-2株疫苗的质量得到WHO认可，已取得WHO预认证，质量可靠，价格合理，同时得到GAVI财政上的支持，因此全球控制乙脑疫苗的时机比以往任何时期更佳。通过国际社会和中国政府的支持与努力，我们有机会拯救和改善数以百万计儿童的生命和生活。

以上不同减毒株的选育经验，特别是SA14-14-2株通过独特的减毒技术，获得一株病毒毒力高度减弱，遗传稳定性良好，同时保持高免疫原性的减毒活疫苗株的经验。将为研发其他虫媒病毒病的减毒活疫苗提供重要科学依据。

利益冲突无