测定病毒感染性的PMA-核酸检测法的研究进展

赵焱

730046兰州,中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室动物生物安全三级实验室实验室生物安全委员会办公室

在病毒的检测领域，快速、灵敏、特异与准确的鉴定方法始终是关注的焦点。通常，基于细胞培养的鉴定方法被认为是金标准，但它需要数天时间才能完成，耗时、耗力。核酸检测法也被广泛地使用，最常见的方法是常规PCR、qPCR和环介导等温扩增反应等，但这些方法无法测定病毒的感染性。近些年，新检测方法的研发从推陈出新的核酸结合染料中找到了新思维。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)可用于病原体核酸提取前预处理样品，使其共价交联于失活病原体的核酸上并阻断核酸扩增，从而区分病原体是否存活[1]。目前，PMA-核酸检测法可检测活的病原体，如细菌[2]及其芽孢[3]、病毒[4-5]、寄生虫[6]等，并应用于不同的领域，如环境卫生、食品安全、病原诊断等。

本文综述了PMA-核酸检测法的基本原理、步骤、优势与局限、各因素的影响及新进展，旨在系统地总结测定病毒感染性的PMA-核酸检测法，为其深入研究和应用提供理论依据。

1 基本原理

PMA是由Biotium公司发明的一种高亲和力、光敏的核酸结合染料。在光解作用下，PMA上的光敏叠氮基团转变为高反应性的氮烯自由基，此氮烯自由基与结合位点的烃基极易形成稳定的氮碳共价键，从而达到永久性的核酸修饰[7]。当PMA修饰到核酸上后，其本身具有的微弱荧光变强，此荧光特性并非PMA-核酸检测法的机理。其机理是共价修饰到核酸上的PMA阻碍了后续核酸检测中核酸与引物等的配对，故而改变了被检核酸的扩增效率。另外，PMA与核酸共价交联后，水分子与多余的游离PMA反应终止了PMA的结合能力，生成的羟胺避免了后续DNA提取步骤中的额外修饰[8-9]。

PMA-核酸检测法的另一个机理是PMA几乎完全不可渗透细胞膜[7]，细胞膜的完整与否决定了PMA是否能接近并修饰核酸及其后续的检测结果[10]。PMA可选择性地穿过破损的病毒包膜与衣壳而结合到病毒核酸，由病毒结构完整性区分了活病毒和失活病毒，从而测定了病毒的感染性。

2 PMA预处理步骤

与常规核酸检测法相比，PMA-核酸检测法在核酸提取的步骤前增加了PMA预处理[11]。PMA预处理病毒的方法是，根据PMA/病毒浓度比，将适量PMA加入病毒悬液后轻柔震荡混匀，样品室温避光孵育5～10 min，再在特定光源的照射下曝光10～30 min，光源需距离样品管10～20 cm，曝光期间样品经常轻柔震荡混匀。

在PMA预处理的过程中，PMA选择性地穿过破损的包膜与衣壳而共价修饰核酸，结合到核酸上的PMA阻碍了后续核酸检测，从而达到测定病毒感染性的目的。另外，Parshionikar[12]利用此法检测水样中肠道病毒时发现，即使样品中有失活病毒存在仍能成功检出活病毒。Bellehumeur证实[13]，PMA预处理含猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床组织样品后，宿主细胞的核酸成分被PMA交联，其后续的核酸扩增被阻断，从而提高了DNA矩阵和高通量测序的病毒检测灵敏性。

3 与其他测定病毒感染性方法的比较

样品中病毒的检测方法各有优劣，但都被广泛地应用于不同的领域。在某些情况下，不仅病毒的量是期待获得的数据，而且病毒的感染性更值得关注。即检测数据同时来源于活病毒和失活病毒[14-15]，故直接测定活病毒的新方法逐渐被关注。

通常，测定病毒感染性的方法可分为两类:第一类是基于病毒的复制能力，第二类是基于病毒的结构完整性。基于病毒复制能力的方法包括动物感染实验、细胞培养实验[5，12，16]及细胞培养与聚合酶链式反应的联用法[17]，依据实验结果可直接判定病毒的感染性，耗时相对较长且成本昂贵；而基于病毒结构完整性的方法主要是衣壳蛋白氧化损伤的检测[18]、酶处理-核酸检测法[19]及PMA-核酸检测法，这些方法相对简单、廉价，依据实验结果只能提示病毒的感染性。与酶处理-核酸检测法相比，PMA的化学特性比酶的更加稳定，不易受其他成分的影响而变性，而且PMA预处理的时间更短，多余的PMA与水反应而失活不会干扰后续实验，故PMA-核酸检测法的应用范围更广。PMA-核酸检测法是一种结合病毒衣壳完整性和核酸稳定性的预测病毒感染性的方法，但通过实验条件的优选及与细胞培养实验的关联，其结果亦可直接判定病毒的感染性。

4 影响因素

4.1 病毒结构 病毒的结构成分包括核酸、衣壳和囊膜。病毒核酸上的烃基是光解作用下PMA的结合位点[7]。PMA-核酸检测法已被用于巴尔的摩病毒分类系统中各主要类型的病毒，如I类(双链DNA)的T4噬菌体和腺病毒、II类(单链 DNA)的ΦX174噬菌体、III类(双链 RNA)的轮状病毒、IV类(正链RNA)的脊髓灰质炎病毒和诺如病毒等，可见此法受病毒核酸类型(DNA/RNA、单链/双链、正链/负链)的影响不大[5，11-12，20-21]。

与囊膜相比，衣壳的结构更加稳固、不易被破坏，能破坏衣壳的因素和强度通常也能完全破坏囊膜，因此本文中讨论破坏病毒囊膜和衣壳的因素以衣壳为主。鼠诺如病毒衣壳由90个二聚体组成，每个二聚体是一个巨蛋白[22]。脊髓灰质炎病毒衣壳由60个亚单位按二十面体对称排列，每个亚单位包括4个病毒多肽，故其能够在生理温度经受构象的改变从而在衣壳完整的状态下失去感染性[23]。各病毒衣壳结构的差异导致了病毒对各灭活方式的敏感性不同，成功的PMA-核酸检测法中各病毒被灭活的温度高低就印证了这一观点[24]。例如，T4噬菌体的热灭活温度为110℃[8]，肠道病毒的热灭活温度为 37℃[12]，鼠诺如病毒的热灭活温度为72℃[24]。因此，对于不同病毒，PMA预处理的实验条件不能混用，都需逐一摸索。

4.2 灭活方式 测定病毒感染性的PMA-核酸检测法的首要关注点是囊膜或衣壳的完整性。与囊膜相比，衣壳的完整性更加稳固、不易被破坏，所以无论病毒是否有囊膜，破坏衣壳的因素和程度是此法成败的关键。常见破坏病毒的方法有高温法、高压法、紫外线法及氯灭活法[5，24-26]，各方法灭活病毒的原理不同，对衣壳完整性的影响也不尽相同，故并不完全适用于PMA-核酸检测法。例如，紫外线仅破坏病毒的核酸[5]，不影响衣壳的完整性，故PMA-核酸检测法不能预测紫外线灭活病毒的感染性。高压仅引起衣壳蛋白的微小变化，并不足以保证PMA接近核酸，因此蛋白酶K与PMA共同预处理病毒可能改进PMA-核酸检测法[25]。

高温法处理病毒是相对可靠、稳定的方法，也是PMA-核酸检测法中研究最多的灭活方式。高温仅破坏病毒的衣壳蛋白[5]，不同温度对衣壳蛋白的效应迥异[12]，可归纳为三类:温度足够高而直接破坏了衣壳的完整性，PMA能进入衣壳并交联于核酸上，PMA-核酸检测法能区分病毒是否存活；较高的温度改变了病毒衣壳蛋白的构象而不影响衣壳的完整性，故致病毒感染性丧失，细胞培养虽能分辨出病毒感染性，但PMA-核酸检测法不能区分病毒是否存活；较低的温度不破坏病毒衣壳而不能作为PMA-核酸检测法的病毒灭活温度。另外，由于各病毒的衣壳组成和结构不同，相同温度对各病毒的处理导致不同灭活结果[24]，故适用于PMA-核酸检测法的病毒灭活温度需通过实验摸索。

游离的氯对病毒核酸和衣壳都有显著作用，通常氯最先损坏病毒核酸，随着氯浓度或剂量的升高而破坏病毒蛋白[27]。Karim等[24]证实了，当低氯Ct值被用于灭活的鼠诺如病毒时，PMA-核酸检测法并不适用；而当高氯Ct值被应用时，PMA-核酸检测法成功地区分了感染性和氯灭活的鼠诺如病毒。因此氯灭活法对衣壳结构的改变足以使PMA进入并交联于被灭活病毒的核酸上[5，12，24]。由于氯破坏核酸的二级结构(如5’NCR)[25]，故需斟酌PCR扩增区域以避免失败。

4.3 实验条件 PMA-核酸检测法的关键参数是PMA/病毒浓度比。最佳比值的选取应该最大化抑制结构破损病毒的信号，即PMA的量相对于病毒的量(或病毒核酸的量)要相对饱和，以保证所有的结构破损病毒的核酸都能被PMA非特异性地封闭，同时过量的PMA与水反应而失去活性。这能有效地抑制结构破损病毒的核酸扩增，而不影响结构完整病毒的核酸扩增。

影响PMA与样本孵育的要素包括孵育时间和温度。孵育时间需确保PMA渗透并交联于核酸上。当PMA/病毒浓度比值高时，孵育时间应尽量缩短以免产生假阳性；反之，孵育时间可灵活调节[1，28]。

在光照阶段，为PMA光解反应提供光源的是卤素灯管[5]、光二极管[29]、Biotium的 PMA-Lite LED光解装置[7]等，这些灯管的功率须符合实验要求。光照距离和时间是优化实验的两个参数。光照时间决定了PMA的活化、与核酸的交联及多余PMA结合能力的终止。充足的照射时间不仅满足了PMA与核酸充分交联的需要，而且通过终止多余PMA的结合能力保证了后续实验的可靠性。常规的照射时间小于30 min，但尚无确切的最优照射时间报道。对于各实验，最优照射时间需根据照射距离不断地摸索、优化。

5 总结

通常，病毒核酸片段的检测结果不足以判定病毒的感染性。然而，无论病毒核酸的类型，PMA-核酸检测法都能测定病毒的感染性。此法不仅受样品处理方式、灭活方式等前处理方案的影响，而且被诸多的实验参数所干扰，如PMA/病毒浓度比、PMA孵育条件、光源的选择及光照参数等。经过实验参数的优化及与细胞培养实验的关联，其结果可更准确地判定病毒的感染性。

PMA-核酸检测法与细胞培养等实验相比，更加简单、廉价，耗时更短，且不易受样品中某些化学成分的干扰。与酶处理-核酸检测法比较，PMA的化学特性比酶的更加稳定，PMA预处理样品的时间更短，多余的PMA与水反应而不会干扰后续实验，故PMA-核酸检测法更具有优势。另外，这种方法检测病毒的种类更多，不仅可检测感染细胞后致细胞病变的病毒，而且可检测感染细胞后不致细胞病变的病毒和在细胞系上生长不良的病毒。此法最大的特点是快捷，故其结果可为公共卫生、应急调查、高级别生物安全实验室管理等提供及时、准确的决策依据。

利益冲突无