循环肿瘤DNA在非小细胞肺癌中的研究进展

郭晓冬,姜晓峰,高 卓

(哈尔滨医科大学附属第四医院 检验科,黑龙江 哈尔滨150001)

组织是肿瘤患者检测最直接的临床样本，但由于肿瘤异质性的存在，目前的单一位点穿刺或活检不能反映肿瘤的全貌，同时，有创检测对于广泛人群的早期筛查以及晚期肿瘤的恶病质患者也并不适用。血浆游离循环肿瘤DNA (Cell-free Circulating Tumor DNA，ctDNA)由于保持着与组织样本一致的遗传信息，现将其作为组织样本基因学检测的替代首选。本文将针对ctDNA的三种检测方法(包括ARMS-PCR，dPCR和NGS)及其优缺点，包括其在NSCLC早期诊断，个性化治疗和耐药性监测，转移复发与预后等临床应用方面做一简要概述，同时针对目前尚未解决的一些问题等方面提出思考意见。

肺癌是世界范围最常见的恶性肿瘤之一，近2/3的患者在发现时已处于肿瘤晚期，由于机体状况差等原因无法或很难获得足量合格的组织样本用于诊断及治疗。液体活检是指从体液中获得来源于组织的生物学标志物，并通过对所得标志物的分析来反映其来源组织的相关信息[1]。这一检测方法具备无创性、广泛性、即时性等特点，具有广阔的应用前景。目前常用的液体活检分析对象主要包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)、外泌体(Exosomes)和游离肿瘤DNA(cell-free tumor DNA，ctDNA)。ctDNA来源于原发和转移的肿瘤组织，存在形式更加稳定且易于检测，可直接使用血浆样本，这种检测在具备无创性和可重复性的同时，还可有效的避免肿瘤本身存在的异质性。故本文就ctDNA在NSCLC中的应用做一介绍。

1 ctDNA的检测方法及优缺点

游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是指一般存在于血浆、血清、脑脊液中，由细胞凋亡、坏死释放入体液的DNA片段，大小约为150-200 bp。正常个体中的cfDNA主要来自于凋亡的骨髓细胞和淋巴细胞，少部分来自于组织。目前cfDNA 已被广泛应用于孕妇产前筛查(NIPT)、移植反应监测和肿瘤的个体化治疗等方面。ctDNA是cfDNA的一部分，特指来源于肿瘤细胞的cfDNA[2]。目前针对ctDNA的检测方法，大体分为以下几类：突变扩增阻滞系统(ARMS)PCR、数字PCR、新一代测序(NGS)等。每一种方法都有其各自的优缺点[3]，下面将其做一具体介绍。

1.1 ARMS-PCR

ARMS是一种在PCR基础上发展起来的检测已知点突变的方法，也称为等位基因特异扩增法。该法通过设计两个5′端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合型突变，分别加入这两种引物及3′引物进行两个平行PCR，需有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到扩增引物，如果错配位于3′端则导致不能衍生扩增，则称为ARMS；该方法可以实现在同一基因中进行两种或多种基因突变位点的检测，届时利用荧光定量PCR平台实现对稀有突变检测，达到提高检测敏感性与特异性的目的。

目前根据ARMS原理检测ctDNA的ADX-ARMS@EGFR试剂盒已经被国家药监局(CFDA)批准，Cobas@ERFR也已经被确定与用来检测EGFR的外显子19的缺失和L858R的置换突变，相比之下dPCR和NGS还尚未得到批准；然而由于ARMS每次都只能检测一种已知基因的突变位点，且有文献表明不同试剂盒对ctDNA的提取结果会造成很大影响，因而在临床上的应用也受到了一定的影响[4]。

1.2 dPCR

dPCR技术是一种新的核酸检测方法，它包括微滴式数字PCR(ddPCR)、乳液PCR和chip-PCR。与传统PCR不同，它的检测优势在于可以对单个突变基因进行绝对定量检测。它的原理是将每一个标准的PCR反应分配至大量微滴中，以每个微滴作为一个独立的反应器进行扩增，扩增结束后，通过荧光信号的比例和数目进行统计后计算出样本中的拷贝数，进而实现检测的绝对定量。

因为它的检测优势，使这种方法的灵敏度和特异性都明显高于其他方法，目前有文献表明，ddPCR是检测EGFR突变最敏感的平台[5]；但是由于引物位置、探针修饰等因素对结果可能造成影响，故检测时应将这些作为结果评估的因素。

1.3 NGS

高通量测序，又名下一代测序，目前的主要检测平台包括三类罗氏454测序仪，Illumina公司的Solexo基因组分析仪和ABI的SOliD分析仪[6]。454测序仪原理是将PCR反应的每一个碱基的延伸和荧光信号先偶联，通过记录荧光信号的强弱和有无，达到实时测定序列的目的；Illumina与454测序仪的原理类似，同样都是SBS(边合成边测序)，但其荧光基团直接连于碱基上；而Solid分析仪连接的序列是8个碱基的探针混合物，根据序列的顺序，样品就可以被探针标记，借此引发荧光信号的产生。NGS可以用于广泛突变的检测，目前对深度测序的开发也是开拓了其应用平台，如SiRe平台，经验证SiRe具有较高的分析性能和0.01%的检测限[7]。然而反应的效率和测序深度对检测结果起到至关重要的作用，此外耗时长，成本高也限制了其在临床上的应用。

除了上述的三种方法外，核酸质谱-色谱联用技术(MALDI-TOF-MS)也可用于ctDNA的检测，该技术的检测原理是将待测样本转换成高速运动的离子，根据不同离子拥有的质核比(m/Z)，对基因进行检测分析。这种方法的检测优势在于检测速度快，可以对样本进行标准化处理，缺点在于全程需要较多的手工操作，对样本的前处理耗时可能较长[8]。

2 ctDNA在NSCLC中的临床价值

2.1 早期诊断

有临床证据表明，ctDNA的含量与临床分期密切相关。但目前对癌症早期ctDNA的检测则成为的临床挑战难题。众所周知，ctDNA占cfDNA的比例很低，故对于其早期检测来说，富集程度和灵敏度的提高显得尤其重要[9]。

近期发表在Nature Medicine[10]上一篇文章中提到了一种全新的ctDNA的检查方法：癌症个体化深度测序分析法，简称CAPP-Seq。该方法集合了目前对于早期ctDNA提取方法存在的问题后加以改进，首先对ctDNA进行捕获，后进行深度测序，即完成了富集化又增加了检测的灵敏度。结果显示，对于Ⅱ-Ⅳ期的NSCLC检测敏感性为100%。Ⅰ期的敏感性为50%，检测结果发现对于比例低至0.02%的ctDNA来说也同样能被检测到，结果得到了ROC曲线的验证结果为0.99和0.95，由此可见CAPP-Seq检测的能力。这一方法的建立对肺癌早期中ctDNA的检测有重要作用，更为ctDNA用于早期肿瘤检测开辟了新思路。

2.2 个体化治疗与耐药性监测

对于NSCLC来说，驱动基因EGFR的突变是最常发生的事件，针对其的分子靶向药物(主要包括酪氨酸激酶抑制剂TKI)更是治疗所必需，有证据显示接受靶向治疗的患者的中位生存期为3.5年，高于非靶向治疗的患者(中位生存期为2.4年)；但个体化治疗后的耐药也是靶向治疗的必然结果。因此对于NSCLC来说，针对性的个体化治疗与及时的耐药性监测更是ctDNA所需要解决的重要问题[11]。

2017年5月发表在Ontarget上的有关ctDNA检测EGRF突变一文中指出了关于运用竞争性等位基因特异性(CastPCR)的方式检测NSCLC中的驱动突变基因的可行性[12]。此实验收集了107名NSCLC患者的血浆样本和与之对应的用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本进行实验，其中以组织样本的检查结果作为金标准以检测CastPCR的检测能力。结果发现检测出的EGFR T790M突变的灵敏性，特异性和一致性分别为54.6%(31/55),94.2%(49/52)和74.8%(80/107)；而PPV和NPV也高达91.2%(31/34)和67.1%(49/73)。该实验方法的意义对于临床的知道指导意义在于，对于组织不可获取的患者来说，可选取这一方法进行筛查突变情况，如发现突变阳性可为临床用药起到一定的指导作用。

同时一项来自于Dana-Farber癌症中心的研究结果显示出微滴式数字PCR在检测治疗疗效和耐药情况的检测结果[13]。该研究为前瞻性实验，患者采用埃罗替尼进行治疗后，观察患者对于治疗的反应情况。对使用此类药物的患者我们进行了连续的监测后发现，在疾病出现的前几周或几个月，大多数患者都已出现ctDNA的分子应答和EGFR T790M的突变。后来的跟踪随访发现在影像学出现改变的前16个月就可以由ctDNA发现耐药性发生突变。

目前针对EGFR基因的突变检测，我国也制定了《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》[14]，该指南对肺癌中EGFR基因突变和靶向治疗做出了明确指示，在大样本III期的临床试验中发现，EGFR基因的检测对治疗晚期NSCLC患者的意义，同时确定了EGFR基因的突变是TKIs个体化治疗和耐药性检测的关键。

2.3 监测术后残留与复发

近期的一篇文章中，针对ctDNA对非小细胞肺癌患者的预后评估能力做了研究。该文是国内首次对肺癌患者术后ctDNA检测的报道，同时揭示了基于二代测序平台检测ctDNA发挥的巨大潜能[15]。该实验选取了30例Ⅰ-Ⅱ期和11例Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者，分别采集了术前和术后的外周血和手术组织样本。通过检测深度大于10000x的Ion Torrent Proton平台(其中包含了50个肿瘤用药耐药基因和肿瘤检测相关的2865个热点突变)进行深度测序。结果显示，27对样本中检测到1个或者多个突变。在驱动基因EGFR、KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA和ERBB2中检测到tDNA和/或ctDNA突变36个。其中大多数(26/36；72.2%)突变为SNVs，其它的突变为插入或缺失(1/36和9/36)。在术前检测到的24个突变中，术后有91.7%的突变位点的突变丰度出现了显著下降。其中，Ia期和Ib期癌症患者血浆ctDNA突变丰度在术后下降最多，而相对较晚期(IIa和IIIa期)的肿瘤患者血浆ctDNA突变丰度下降较少。这证实了ctDNA能够实时敏感地反应患者的肿瘤基因突变信息和肿瘤负荷，并且可用于检测肿瘤患者术后微小病灶残留，评估肿瘤复发风险。

该实验重点展示了ctDNA在检测微小病灶及转移复发方面的优势，同时与传统的肿瘤标志物相比，ctDNA更能直接反应出在治疗检测中的价值，对临床治疗的全程可以提供更明确的指导。

3 存在的问题及解决方法

3.1 如何提高ctDNA的检出率

ctDNA在血液中的浓度多低于100 μg/L，平均约为30 μg/L。研究表明，ctDNA的含量会随着肿瘤的进程而增加。癌症早期或缓解期比例可低至游离DNA含量的0.01%-1%，在中晚期约占8%-10%[16]，但ctDNA提取中往往会混有其他背景DNA片段，会极大影响结果的判读，因而ctDNA的检出率在整个测试过程中尤其重要。

据现有文献的报道，提高ctDNA的检出率的方法大概可以总结为四类。前两种方法有相似之处，均为通过推测ctDNA的来源进行更进一步的深入检测，因为对驱动突变的针对性更强，所以检出率会得到一定程度的提高。一种由华盛顿大学的研究人员明确，利用深度测序推测核小体模式，进而推断不同基因的表达情况，再将其与不同细胞和组织的RNA数据库进行比对，从而推断具体的病变部位[17]；另一种则是通过全基因组测序，推测其原发部位的表达量。通过对基因转录起始点核小体的结合情况来反应转录状态，间接推测基因表达量[18]。第三种方法则是基于有研究发现ctDNA比cfDNA更短[19]，因而对于肿瘤细胞来说筛选出较短片段的ctDNA对于检测突变灵敏度更重要。第四种是纠正实验算法，可提高检测下限。若ctDNA本身的含量低，背景DNA会导致检测假阳性率的上升。据统计，当等位频率低于0.02%时，假阳性率可高达50%。针对这一问题，斯坦福大学研究团队研究了一种iDES的算法[20]，该算法可检测低至0.004%的突变频率。该算法包括两部分，一是提高ctDNA的标记技术，二是纠正算法去除背景，将错配的碱基进行剔除。经检测该方法的SNP错误率可至最低，阳性预测值可达72%，对于EGFR突变的检测的灵敏度可达到92%，特异性达96%；而且针对不同时间点的ctDNA检测后发现，检测限可低至4/105，以上这四种方法大大提高了预测性与检出率。

3.2 血液之外的体液样本检测

我们俗称的体液大部分都是指血液样本，但是对于肺组织来说，痰液无疑是其最直接的体液样本。近期由David Wong博士率领的研究小组完成了一项研究[21]，利用EFIRM(电场诱导释放和测量)新技术来检测肺癌患者中EGFR基因的两个致命突变即L858R和外显子19缺失。该实验选取了40例NSCLC肺癌患者的痰液样本进行检测，其中证明用该方法检测到了22例NSCLC患者的EGFR突变，结果表明EFIRM检测到外显子19缺失的ROC面积为0.94，检测到L858R的ROC面积为0.96。对于肺癌来说，该技术的成功为肺癌的诊断提供了一种更加无创，低成本收益和快速的检测手段，同时也为肺癌的液体活检开辟了一条新思路。

3.3 关于检测的标准化问题

ctDNA的检测相对复杂，存在多种检测平台，且涉及到许多方面，包括样本的前处理、质控、提取、上机、数据分析等工作，这些对标准化来说至关重要。由于缺乏行之有效的标准化操作流程和数据分析方法，使大量数据无法整合，这使ctDNA的检测和应用在临床上受到了一定限制。

3.3.1质控品，标准品的制备 目前就质控品来说，有研究建议将包含突变位点的细胞系基因组DNA和重组质粒作为检测的质控品，而它的具体制备方法和检测限度的确定，目前还尚未统一。

近日，来自卫生部临床检验中心的研究人员，建立了一种通过微球菌消化和CRISPR基因编辑技术来制备cfDNA质控品的方法[22]。研究人员通过微球菌核酸酶消化HEK293T细胞系，并用PCR定点突变和CRISPR/Cas9基因编辑技术，制备出了包含多种常见突变的质控品，并通过常用的cfDNA的常用检测方法进行了验证，结果可信。该实验结果的验证为cfDNA质控品的建立奠定了基础，但临床推广还值得商榷。至少目前值得肯定的是，作为质控物和标准品的细胞系基因组DNA和重组质粒，应具备以下两个基本特点[23]：1.质控品和标准品片段大小应与ctDNA片段大小类似2.其应包括广泛的遗传变异类型，如单核苷酸变异，染色体插入，缺失，异位等突变。这一点毋庸置疑。对于标准品，英国Horizon Discovery 公司研发了商品化的ctDNA标准品，它同样来自于细胞系基因组DNA[24]。

3.3.2标准操作流程简介 标准操作流程主要包括从血液采集到血浆运输与储存直至提取整个过程。类比检验前、检验中和检验后三个程序来说，检验前的标本合格与否，会直接影响最终的检测结果。目前推荐的标本前处理方案大致如下：采用cfDNA专用常温采血管进行血液采集(在采血过程中尽量避免血液回流，建议采血约10 ml后颠倒混匀)，保证血液质量无误后立即送检；离心(建议1600*g，10 min)，收集血浆层，再离心后分装。而后进行cfDNA的提取，目前建议采用上述提到的Cobas DNA Sample Preparation Kit试剂盒进行提取，后用TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒进行荧光定量检测，但目前这只是理想化的提取方法，具体操作步骤的制定，还没有明确操作指南。

3.4 检测平台的合理利用

3.4.1dPCR 耐药性的突变的确定是ctDNA能否向临床实验室转化的关键。近日有研究者对常见检测平台进行比较分析后得知：dPCR对于耐药性检测是最适合的检测方法。近日，阿斯利康公司研究团队对血浆ctDNAd EGFR突变进行了多个检测平台的比较后发现，COBAS EGFR突变检测法和数字PCR中的BEAMing dPCR技术对于监测耐药，表现出高敏感度(78%-100%)和高特异性(93%-100%)。研究者们先用38例样本进行评估，发现对于常见的T790M突变来说，数字平台(71%)明显优于非数字平台(29-41%)。而后增加至72例后进行血浆样本的评估，发现前者的特异性和敏感性分别为73%和67%；后者为81%和58%；以上结果表明对于耐药性的突变检测来说，这两种方法与其他检测方法相比，较为敏感和特异[25]。

3.4.2NGS 虽然dPCR在检测耐药性方面优势明显，但由于dPCR尚未得到合理审批，相比之下，NGS在北京，上海，浙江等地的贝瑞和康创新技术已经通过《国家卫生计生委医政医改局关于肿瘤诊断与治疗项目高通量测序技术临床应用试点工作的通知》；此外对于非T790M基因突变的肺癌患者来说，NGS检测则显得更加意义明确。同时临床上对于精准、全面、统一，价格相对低廉的多基因检测需求更是推动了NGS的发展。 有文献指出，全基因组测序NGS不仅可以筛选突变，还可以筛选出重排和拷贝数畸变，并提供个体遗传基因组调查结果。如上述提到的CAPP-Seq，则可以识别超过95%的肿瘤中的突变。除了确定突变特征之外，还测序可提供个性化治疗，跟踪突变载荷和抗性机制的发生。由于了解整个分子的组成才能使我们能够选择最佳治疗方案，这样看来，NGS似乎是临床应用时最适合的检测技术[26]。

同时有学者连续对晚期非小细胞肺癌患者102名获得的112名血浆样品进行前瞻性研究，发现高达70个基因的超深度测序与组织样本匹配。在45个基因中检测到275个突变，102个患者中86个的ctDNA中至少有一个改变患者(84%)，其中EGFR变异最常见。 ctDNA NGS检测到50个驱动和12个抗性基因和22个其他基因的突变。 而连续102例患者完成ctDNA NGS，组织测序仅为50名患者成功(49%)。 在24个组织和19个ctDNA中检测到可行的EGFR突变样品，产生79%的一致性，且发现组织和采血之间的时间间隔更短，一致性越高。此实验用数据充分证明 ctDNA NGS的临床应用价值[27]。

3.4.3数据的处理与分析 2016年4月23日，中国临床肿瘤学会(CSCO)和中国肿瘤驱动基因分析联盟(CAGC)联合发布了《二代测序(NGS)技术应用于临床肿瘤精准医学诊断的共识》。该共识对信息学分析提出了要求，具体如下：生物信息学流程必须针对所使用的技术平台；任何化学成分的改变、浓缩方法或生物信息学分析平台应该保证后续的有效性；诊断实验室必须验证所有的生物信息学流程(公用工具或商业软件包)的标准信息设置，以确保相关数据更改后(新版本)及时跟进，诊断实验室应使用当前注释相关变异体的结构化数据库。该共识意见对生物信息学方法做出了具体要求，对ctDNA的数据分析和处理起到了更加明确的指示作用。

3.5 尚未解决的问题与思考

3.5.1ctDNA含量与分期 分期对于肿瘤的诊治尤为重要，目前我们还停留在ctDNA检测的起跑线上。对ctDNA的定量检测后，是否可以实现这两者的相关性研究，这路途还很遥远。同时这也是实现ctDNA能否向临床转化的关键。可以设想未来如果可以通过对ctDNA的绝对定量检测从而实现对肿瘤的分期，甚至可以实现确定哪个范围为用药人员，哪个范围为手术人员，这对于早日实现“精准医疗”是有所裨益的。

3.5.2对ctDNA检测人员的规范化培训 由于ctDNA本身含量少，丰度低。因而精准提取对于检测结果来说显得至关重要。建议应定向培养专业的检测技术人员对标本进行完好的处理(其中最重要的是降噪处理)来有效避免人为因素导致的检测误差；此外还包括定价问题。正如现在的检验项目一样，不同的检测方法，试剂耗材会有所差异，对于不同的ctDNA检测方法，也应采取不一样的收费标准，对于患者来说，这也更加合理。

结语

对于NSCLC来说，液体活检正发挥着巨大的潜能。针对液体活检中的ctDNA，其各自提取和检测方法的不足之处还有待完善；针对NSCLC的早期诊断，个体化治疗及耐药性监测，甚至包括预后复发评估的意义也将伴随着提取和检测方法的改进而更加意义明确。但是对于检测后的数据统计分析方面，目前我们了解的还甚少，故建议将这一部分作为以后的研究热点。同标准化一样，尽早制定出相对完善的共识意见；此外其他液体活检的研究还方兴未艾，探讨它们的联合检测的意义，任重而道远。

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