TGF-β信号通路与软骨终末分化及骨关节炎

万小满，闫继红

(1.首都医科大学基础医学院 13级七年临床医学儿科，北京100069；2.首都医科大学基础医学院 组胚教研室)

骨关节炎(OA)是一种慢性退行性关节疾病，在中老年人群中发病率高，严重者可致残，从而影响人们的生活质量。

其病理改变涉及关节整体结构，包括关节软骨破坏，软骨下骨硬化，骨赘形成以及滑膜增生等[1]。目前已知的有关病因主要与年龄、性别、力学压力(肥胖)以及创伤有关[2]。然而有关骨关节炎发生的精确的分子机制目前还不完全清楚。

最近转基因小鼠研究表明转录生长因子-β(TGF-β)信号通路在OA的发展中发挥关键的作用，可促进软骨细胞向肥大化发展，促进骨原细胞分化成成骨细胞和软骨下骨中的血管生成，以及刺激滑膜相关细胞增殖和滑膜的纤维化[3]。

TGF-β信号通路是一个包含众多成员的多功能细胞因子的超家族，主要调节细胞的生长、增殖、分化、迁移和凋亡等过程[4]。在软骨发生中，TGF-β信号发挥着重要的功能，包括间充质细胞聚集、软骨细胞增殖、细胞外基质沉积和最后终末分化都起重要作用。有研究报道：TGF-β不仅可以引发软骨基质的合成，而且也可以参与OA的发生及发展过程。如参与：(1)募集前成骨细胞；(2)软骨下骨的病理重建；(3)骨赘的形成，促进软骨细胞的终末分化等。本文就目前TGF-β信号通路在骨关节炎的发生中的有关调节机制予以综述。

1 TGF-β信号通路

目前已知在TGF-β信号通路超家族中除了 TGF-β外，还包括活化素(activin)、抑制素(inhibin)、生长分化因子(GDFs)、骨形态发生蛋白(BMPs)等不少于35个成员组成。TGF-β超家族信号通路中与软骨发育有关的主要为Smad2/3介导的TGF-β信号通路与Smad1/5/8介导的BMP信号通路。其中由TGF-β信号引发的Smad信号通路在软骨和骨关节炎的发生中越来越受到关注。经典TGF-β信号通路(BMP信号通路作用类似)主要通过TGF-β配体-膜受体(Receptor)-Smad信号通路发挥诱导成软骨的生物功能。TGF-β受体分为TβRⅠ型、TβRⅡ型和TβRⅢ型，其中TβRⅠ起着承上(与TGF-β结合)和启下(活化Smads)的作用，配体与TGF-βR结合导致TGF-βRⅡ磷酸化，活化的Ⅱ型受体构象发生改变并识别Ⅰ型受体，对Ⅰ型受体胞内侧丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，活化后的Ⅰ型受体活化细胞内效应分子Smad，进而调控一系列生物学功能[3]。

1.1 TGF-β配体

在哺乳动物中，有三种TGF-β，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，[5]且这3种TGF-β在软骨细胞与肥大的软骨细胞中均有表达[6]。

TGF-β是间充质前体细胞软骨发生的主要发起者，间充质干细胞(MSCs)分化为软骨细胞也需要TGF-β的作用，通过TGF-β的强烈刺激诱导N-钙粘蛋白的表达，来增强细胞粘附，使细胞聚集。随后促进细胞的增殖以及软骨特异性细胞外基质分子的沉积[7]。研究表明TGF-β是通过调控Sox9的表达来作为软骨分化的正调控因子[8]。

大量研究已表明TGF-β与对软骨发生具有重要的作用。研究发现TGF-β3可以刺激细胞外基质的合成，在急性软骨损伤的兔子模型中，可以提高软骨的细胞外基质的量[9-11]。

注射有活性的TGF-β1在受损的软骨区，可分泌Ⅱ型胶原蛋白以及产生粘连蛋白使软骨细胞能附着在受损部位[12，13]。最新的研究结果类似，Tang，Y等人通过腺病毒将TGF-β1基因转染到兔子软骨细胞中，结果显示TGF-β1可以长时间的发挥作用，包括使软骨细胞由多边性变为梭形或卵圆形，DNA合成以及聚蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白表达均增加，而Ⅰ型胶原纤维表达明显减少，另外明显促进软骨样基因Sox9的mRNA的表达，并阻止肥大标志物COL10A1，减少MMP-13[14]。还有研究表明，TGF-β1可以有效的阻断BMP9诱导的Smad1/5磷酸化和软骨肥大样改变[15]。

然而一些研究则显示，TGF-β对软骨还存在一些负面作用。它能诱导人的软骨细胞MMP-13[16]和马正常软骨细胞的MMP-9[17]的合成增加。对于滑膜细胞，能增加MMP-1、聚蛋白多糖酶以及促炎因子的表达[18]。这些基因表达的提高会导致软骨分解的加速。而局部TGF-β的聚集将会导致关节软骨产生骨关节炎样变化。在体外和动物模型中也都证明TGF-β信号与骨关节炎的发生相关。体内的实验证明，在骨关节炎的发展中，TGF-β1和BMP2作为配体，活化Smad3，促进MMP13的表达，导致人骨关节炎的发生和正常软骨的破坏[19]。另外，异常激活TGFβ1导致软骨下骨异常重塑和骨髓骨样小岛的形成[20]。

这些实验结果表明，TGF-β在软骨和骨关节炎的发生中的作用是存在争议的。

1.2 TGF-β受体

TGF-β受体分为TβRⅠ型、TβRⅡ型和TβRⅢ型，其中TβRⅠ起着承上(与TGF-β结合)和启下(活化Smads)的作用。研究发现，软骨细胞TGF-β不仅通过经典的Ⅰ型受体ALK5介导Smad2/3信号，而且还可以通过ALK1受体介导Smad1/5/8通路[21]。

通过受体ALK5磷酸化Smad2/3的TGF-β信号通路可以使软骨分化开始，但对软骨终末分化有阻止作用。而通过受体ALK1/2/3磷酸化Smad1/5/8的BMP信号通路对于软骨终末分化是有重要意义的，缺失Smad1和Smad5会阻碍软骨细胞终末分化，并造成软骨功能障碍。

有研究表明，随着年龄的增加会减少ALK1的表达，但是，它减少的速度不如ALK5，提示在老化的软骨细胞中，会由通过ALK5的Smad2/3信号通路转向通过ALK1的Smad1/5/8信号通路，ALK5/ALK1比例的减小会导致软骨细胞向骨关节炎特征表型的肥大方向分化[22]。van der Kraan等[22]的实验也获得相似的结果，年龄可导致ALK1/5的比例改变，发生软骨肥大，此外，还发现人的骨关节炎软骨中ALK1与MMP13的表达呈现出显著的相关性。由此可见，在骨关节炎的软骨细胞中，ALK5的减少改变了ALK5和ALK1的比例，从而TGF-β信号偏向于Smad1/5/8信号通路，使软骨细胞发生终末分化。

1.3 Smad蛋白

Smad主要可分为三类，调节受体型Smad：Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，通用型：Smad4，负调节型Smad:Smad6和Smad7[24]。

大量研究证明负调节型Smad通过招募泛素化酶作用于相关蛋白，引起信号关闭。常见的泛素化酶包括Smurf1和Smurf2。

已有研究显示Smad6和Smurf1是Smad1/5/8的BMP信号通路的抑制物，而Smad7和Smurf2则抑制Smad2/3信号通路。Smad6和Smurf1过表达的大鼠软骨细胞中显示正常的细胞增殖状态，阻碍了软骨细胞终末分化。在分化的鸡软骨细胞中，Smad6的过表达阻断BMP-2诱导的软骨细胞肥大。此外Smad6可与Runx2相互作用，增强Runx2通过蛋白酶体途径降解。相反，在软骨细胞中过表达Smad7，抑制了Smad2/3信号减少了软骨细胞增殖，加速软骨细胞的终末分化[24]，促进骨关节炎的发生。此外，Smad7可下调p38MAPK蛋白激酶信号通路，阻止前软骨细胞的分化过程[25]。

Smurf不仅可促进Smad降解而且可调节ALK半衰期。过表达Smurf1可通过减少Smad5，抑制Smad1/5/8信号，防止终末分化。相反，过表达murf2可下调ALK5水平[26]，抑制Smad2/3信号，加速软骨终末分化，促进骨关节炎发生[27]。发现对体内发现Smurf2功能缺失的小鼠可以减缓半月板损伤后骨关节炎发生的严重程度[28]。

由此可知：过表达Smad7和Smurf2或下调Smad6和Smurf1都会引起软骨终末分化，促进骨关节炎的发生。

2 机械压力与TGF-β信号通路

在引起骨关节炎发展的主要因素中，一个是生物因素，另一个重要因素是压力诱导的软骨损伤。

动物实验研究表明，关节负荷过重会导致Sox9，Ⅱ型胶原蛋白表达减少，表现为关节软骨丢失和软骨下骨密度降低[29]。

有研究表明，机械压力会抑制软骨中ALK5介导的Smad2/3通路的激活，但与年龄有关。老龄软骨对机械压力引起的ALK5-Smad2/3通路抑制作用更加明显著，Ⅱ型胶原蛋白和纤维粘连蛋白表达相对于年轻软骨大大减少[30]。有研究表明，人关节软骨机械损伤导致Smad1和Smad5的磷酸化，Wnt信号上调，进而改变R-Smad信号平衡，刺激软骨细胞的终末分化[31]。

软骨细胞凋亡与骨关节炎密切相关[32]。 最近有研究显示，机械压力可通过上调miRNA-146a，进而抑制Smad4蛋白表达，诱导软骨细胞凋亡，促进OA的发生[33]。

但也有实验表明，过度的机械压力单独不会造成TGF-β信号由Smad2/3向Smad1/5/8转变，相反，可保护关节软骨，阻止软骨的终末分化[34]。

3 TGF-β信号与其它信号通路交互共同调节软骨分化

3.1 Wnt信号通路

Wnt信号系统在软骨分化和软骨发育中起重要作用。增强Wnt信号可直接对软骨细胞分化产生影响，也可以通过调节Smad2/3和Smad1/5/8途径的平衡来产生效应。 有研究证实，经典的Wnt信号通路可以使TGF-β信号通路由ALK5介导的Smad2/3信号通路转向ALK1介导的Smad1/5/8的BMP信号通路，导致软骨细胞肥大，这可能是骨关节炎的病理机制之一[35]。

3.2 MAPK信号通路

研究发现，在OA软骨中，p38MAPK的磷酸化增强[35]。 MAPK磷酸化，将改变Smad2/3与Smad1/5/8信号之间的平衡，促进软骨终未分化[36]。

TGF-β可依赖p38信号通路介导Smad通路调节Sox9的磷酸化及其下游基因papss2 mRNA的表达。Sox9上第211个丝氨酸的作用位点负责应答TGF-β信号，而这个位点也是p38激酶的一个靶点，p38和Smad3可共同调节Sox9的表达[37]。

此外，TGF-β1通过 ERK1/2激酶磷酸化Smad3，诱导基质蛋白酶抑制剂(TIMP-3)的上调[38]，而单独ERK1/2并不能发挥作用。

4 TGF-β在治疗骨关节炎中的应用

TGF-β家族，主要包括TGF-β1、TGF-β3或BMP-2，已证明能促进软骨再生，而用于软骨组织工程中。

TGF-β1可以抑制软骨基质降解酶和促进软骨分解代谢的细胞因子白介素(IL)1。另外，TGF-β1能增强骨髓间充质干细胞的成软骨能力。因此，TGF-β1可作为软骨修复一个不错的选择[39]。临床试验证明，TGF-β1基因修饰的软骨细胞，具有修复损伤的软骨的作用[40]。有研究显示TGF-β3基因通过病毒感染到MSCs，可治疗OA引发的软骨损伤[41]。

然而，注射高剂量的TGF-β1进入关节内可诱发炎症细胞的趋化和激活，导致典型的软骨缺陷如纤维化和骨赘的形成[42]。因此，TGF-β1应该管理在合适的范围内，将负面影响降到最低。

此外，由于TβRⅡ与软骨细胞基质的表达具有相关性。因此可以在软骨细胞中高表TβRⅡ或者ALK5作为治疗骨关节炎的手段。

5 问题与展望

目前，我国人群中骨关节炎的发病率很高，严重地影响了人们的生活质量。由于骨关节炎病因复杂，目前临床上尚无有效的治疗手段和药物。阐明骨关节炎发病的分子机制对于更深入地研究有效的治疗方法具有重要的意义。

TGF-β信号通路在调节关节软骨的再生起了非常重要的作用，TGF-β信号通路中各种分子将可作为OA治疗的靶点。因此，合理掌握TGF-β使用的剂量，通过阻滞ALK1，选择性激活不同的Smad信号以及关键的下游靶基因，可以作为治疗和干预OA疾病的潜在关键目标[3]。

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