甜菜SRAP扩增产物不同检测方法的比对研究

孙燕红 ，马龙彪 ，2，3，兴旺 ，2，3，吴则东 ，2，3*

（1．黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨150080；2．中国农业科学院甜菜研究所/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；3．中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080）

甜菜作为我国一种重要的糖料作物，在我国的发展从无到有，又经历了上个世纪快速发展，1988年仅黑龙江省的甜菜种植面积就达到了约600万亩（40万hm2）[1]，进入新世纪以来，由于国际市场的冲击，许多糖厂纷纷倒闭，甜菜的种植面积也在不断的萎缩。但从十三五开始，受到国家利好政策的影响，甜菜种植面积开始逐步提升，目前全国甜菜的种植面积在300万亩（20万hm2）左右。

目前已有多种分子标记技术应用到了甜菜的许多方面，如 RFLP[2]、RAPD[3]、AFLP[4]、SRAP[5-6]、SNP[7]以及SSR[8]等，这些分子标记技术在甜菜遗传多样性分析、品种鉴定、基因克隆以及抗病基因的定位等许多方面发挥着重要的作用。SRAP分子标记由于具有引物量大，通用性好，已经广泛应用到了多种作物上，如棉花[9]、香蕉[10]、菊苣[11]、苦荞[12]、甘薯[13]、木瓜[14]、梅[15]、玫瑰[16]等。 SRAP 分子标记技术在甜菜上的研究，国内研究的较多，如王华忠等[17]构建了SRAP分子标记的扩增体系；王茂芊等[5，18-20]利用SRAP分子标记对甜菜的抗根腐病品种、抗褐斑病品种以及不同区域的品种进行遗传多样性分析；王华忠等[21]同时采用SRAP和SSR分子标记技术对不同类型的甜菜进行了遗传多样性分析。SRAP分子标记扩增产物的检测方法一般分为两种，一种是使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测[9，13]，一般使用的缓冲液是0．5倍的TBE；另外就是通过琼脂糖凝胶电泳检测[15-16]，使用的缓冲液是1倍的TAE。吴则东等人比较了变性聚丙烯酰胺凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶的区别，发现两者之间差异不大，但非变性聚丙烯酰胺凝胶无论是制胶还是检测都要比变性聚丙烯酰胺凝胶更加简单，故推荐非变性聚丙烯酰胺凝胶替代变性聚丙烯酰胺凝胶[22]；目前SRAP分子标记在甜菜上一般都是使用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测[6，18，20-21]，那么甜菜SRAP分子标记技术在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测上到底有多大的区别，哪种检测方法更加适合，本文将就此进行研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验中用到的 8 个甜菜品系：HW-10、HW-6、2N03208、H1492、JV14、TH46、NH6、JV34，均来自于黑龙江大学农作物研究院甜菜高品质品种改良课题组，分别以编号1～8代替。实验中用到的引物均来自于文献[16]。

1.2 实验方法

分别采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和2%的琼脂糖凝胶电泳对SRAP扩增产物进行分离，电泳结束后，利用1倍的Gelred核酸染料进行泡胶10min，用凝胶成像系统进行拍照。

在购物方面，旅行社会提供游客多种选择，涵盖旅游目的地豪华的购物中心以及富有菲律宾民俗风情的特产店、集贸市场。就赴菲游客而言，在购物中心购物的风险较小，能够享受更舒适的购物环境以及获得高质量的商品；在集贸市场或景区外的特产店的感知风险更高，其原因可能是该类购物场所人员复杂，容易发生盗窃事件，商品的质量不能得到较好的保证等等。

1.3 数据处理

在同一迁移率位置，有带记为1，无带记为0，计算不同引物的多态性条带以及总条带数，分析不同引物在不同凝胶系统上电泳的差异。

2 结果与分析

试验所得的多态性条带和总条带数见表1。实验中用到的9对SRAP引物，有3对引物在6%的聚丙烯酰胺凝胶和2%的琼脂糖凝胶中扩增出的多态性条带数以及总条带数均相同，另外6对引物6%的聚丙烯酰胺凝胶中扩增出的条带无论是总条带数还是多态性条带数均高于2%的琼脂糖凝胶，但差异不大。图1为引物EM16-ME19在不同凝胶系统上的扩增结果，从图1可以看出，虽然两种凝胶扩增的多态性条带和总条带数均相同，但6%聚丙烯酰胺凝胶上的一些杂带在2%的琼脂糖凝胶上并没有显现出来，这对于条带的分析非常有利。

3 结论

SRAP分子标记技术由于多态性比较好，引物数量较多，且适用于所有的物种，因此自开发以来就得到了广泛的应用。本文分别通过利用两种不同的凝胶系统对甜菜SRAP扩增产物进行检测，发现甜菜SRAP分子标记多态性较好。而且通过两种凝胶系统的检测后发现，2%的琼脂糖凝胶在多态性条带的检测上一般和6%的聚丙烯酰胺凝胶相差不大，有的引物检测的条带数会略低于6%的聚丙烯酰胺凝胶，但2%的琼脂糖对于扩增较弱的一些产物基本上没有显示，因此读带相对比较容易，另外琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶来说，制作比较简单，凝胶本身又没有聚丙烯酰胺凝胶原料（包括丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED以及过硫酸铵）的毒性，同时在显影上，由于使用无毒的核酸染料，使得琼脂糖凝胶电泳从制作到检测均不涉及有毒物品，因此推荐甜菜SRAP标记的检测使用2%的琼脂糖凝胶电泳。