浅谈食品中蛋白质含量测定方法优缺点

□ 常 虹 海南省食品检验检测中心 唐 帅 海南省食品药品检验所琼海分所 罗小菊 海南省食品检验检测中心

1 常规食品中蛋白检验方法

食品中蛋白质是人类最重要的营养物质之一，准确测定蛋白质含量是食品检验工作的一项重要内容[1]。食品中蛋白质的测定具有十分重要的现实意义，食物中准确的蛋白质含量为合理配膳提供数据，掌握食品的营养价值和品质的变化，保证不同人群对蛋白质的需要[2-3]。

目前，我国的现行国家标准中有3个可以测定食品中蛋白质的理化方法，分别为GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》中的第一法凯氏定氮法、第二法分光光度法、第三法燃烧法[4]。此外，还有双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）等检验方法，可以对食品中的蛋白质进行定性和定量的测定。作为食品理化检验工作从业者，笔者结合平时的检验经验，分析检验标准浅谈凯氏定氮法、分光光度法、燃烧法、双缩脲法（Biuret法）的优缺点，同时参考相关文献，以进一步证实笔者的总结。

2 各类方法优缺点比较

2.1 凯氏定氮法

2.1.1 测定原理

在催化加热条件下，食品中的蛋白质被分解，分解后的产物氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收游离氨后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法[5]。在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并被过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，根据标准溶液的消耗量计算出样品中的氮量。

2.1.2 优缺点分析

优点：①测定结果相对准确，重现性好，在国内各大检验机构中比较普及；②灵敏度低、干扰少，适用于0.2～1.0 mg氮，误差为±2%。

缺点：①一般测定时间为8～10 h，费时且试剂消耗量大；②有局限性，即难以把有机物定量转变成氨，特别是含有硝酸盐的样品会影响总氮的结果，影响测定准确性。

2.2 分光光度法

2.2.1 测定原理

在催化加热条件下，食品中的蛋白质被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，其在pH 4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm下测定化合物吸光度值，将其与标准系列进行比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2.2.2 优缺点分析

优点：①简化了操作，省去了蒸馏、滴定的步骤，使用常见的分光光度计，便于广泛推广应用，为蛋白质的测定提供了凯氏定氮法的简化方法；②消化时间相对较短，所用消化设备简便，常用，易于推广测量灵敏度高、快速，方便低浓度蛋白质含量可检测。本法采用硫酸铵作为铵离子标准溶液，避免引入其他杂质。

缺点：易受溶液中杂质的影响、干扰因素较多，存在潜在的偏差，标准曲线不易绘制精确。

2.3 燃烧法

2.3.1 测定原理

试样在900～1 200 ℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，氮氧化物被全部还原成氮气，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，形成的氮气气流通过热导检测仪（TCD）进行检测。

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2.3.2 优缺点分析

优点：①操作简便，检测周期短检测样品无需消化，自动进样，5～8 min即可完成一个样品的检测；②检测数据误差更低，由于凯氏定氮法与燃烧法在实验原理上的不同，在实际检测中，同个样品用两种方法检测有时会出现不同的结果，而且实验发现燃烧法检测出来的数据略高于凯氏定氮法；燃烧法能够将样品中的氮元素全部检测出来，以动物性蛋白样品为例，凯氏法只能测定出其中的有机氮，而燃烧法可以测出有机氮和无机氮；③检测过程少污染，蛋白质燃烧法检测过程中不产生有毒有害物质，清洁，环保。

缺点：①对于不均匀的复杂样品分析难度较大，样品需要确保研磨均匀而且要较细颗粒，否则易出现燃烧不完全的情况，进而影响后续的检测结果；②仪器耗材消耗快，仪器昂贵，检测成本高，在净化过程中，燃烧过程中产生混合气体被适当的吸收剂除去。这些吸收剂在大批量的样品检测中有较大的消耗量，需经常更换。而且燃烧法中用到的仪器杜马斯定氮仪本身价格较为昂贵，因此限制了这一方法的推广和应用。

2.4 双缩脲法（Biuret法）

2.4.1 测定原理

双缩脲法是一个可以用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是碱性的含铜试液，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制，呈蓝色。当底物中含有肽键（多肽）时，试液中的铜与多肽配位，生成的配合物呈紫色[6]。在紫外可见光谱中的波长为540 nm，可通过比色法分析浓度。检测反应的灵敏度为5～160 mg/mL。

2.4.2 优缺点分析

优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，干扰物质较少。

3 结语

基于凯氏定氮法的重现性较好，即便其消化时间长，目前国内各大检验机构主要采用常规凯氏定氮法。原因在于先进的蛋白质测定仪价格昂贵，且需专门试剂，目前尚难普及[7]。然而，就检验时效而言，凯氏定氮法确实越来越难以满足目前市场的要求，故应当从改进凯氏定氮法消化时间方面进行技术方面的改进[8]。目前已有相关文献对于凯氏定氮法的消化过程进行改进：用过氧化氢-硫酸混合液为消化试剂，加液方式由一次性加入改为定时定量、逐滴缓慢加入，取代了凯氏定氮法复杂的消化体系和操作步骤，使反应更加充分、快速[9]。因此，显著缩短了消化时间，是常规消化法消化时间1/12。样品经快速消化法消化后，其粗蛋白含量测定结果与常规消化法基本一致。说明快速消化法不仅消化效果完全、可靠，而且省时、快速，尤其适合于大批量蛋白质的测定分析。

国 家 标 准 GB 5009.5-2016 中 的第三法燃烧法是比较理想的快速便捷方法，但由于仪器耗材消耗快，仪器昂贵，检测成本高，在净化过程中，燃烧过程中产生混合气体被适当的吸收剂除去。这些吸收剂在大批量的样品检测中有较大的消耗量，需经常更换（如用来吸收酸的铁丝，用来吸收氯的黄铜，用来吸收多余氧化物的碳粒以及吸水剂高氯酸镁等）。而且燃烧法中用到的仪器杜马斯定氮仪本身价格较为昂贵，因此限制了这一方法的推广和应用。当然，有条件的实验室可以应用该方法，建议收集各实验室的数据加以进一步验证该方法的准确性。

综上所述，蛋白质的检测方法各有优缺点，检验检测机构应该结合本单位实际，选用符合本单位的检验检测方法去进行相关检测工作。