应用高效液相色谱法检测食品中黄曲霉毒素

2018-01-17汪恩婷邹振宇重庆市计量质量检测研究院

食品安全导刊 2018年36期

□ 汪恩婷邹振宇杨皓杨京重庆市计量质量检测研究院

黄曲霉毒素广泛存在于各种粮油食品及坚果食品中。由于黄曲霉毒素具有极强的毒性及致癌性，长期食用含有黄曲霉毒素的食物会对人体和家畜带来较大的危害。利用高效液色相谱法检测黄曲霉毒素能够显著提高检测的灵敏度。目前，黄曲霉毒素的结构、特点、性质等信息已经被研究透彻，但就我国的技术条件来说，传统的检测方法达不到国际规定的要求，因此急需进行相关检测方法的研究。

1 黄曲霉毒素的危害分析

黄曲霉毒素是一类化学结构类似霉菌毒素，由二氢呋喃香豆素衍生而来，在气候湿热的一些地区的食物中容易产生。自然界中土壤、坚果食品及动植物种均存在黄曲霉毒素，尤其是玉米、小麦、花生等农作物加工产品容易受到污染，通过食物进入人体后，对人体的危害极大。黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，其毒性极强，远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以黄曲霉毒素B1的毒性最大。2016年的相关调查数据显示，欧盟共发出2 993份有关黄曲霉毒素的通报信息，其又产生7 288条跟踪信息，比上一年增长11.1%。报告中，与我国息息相关的通报多达50条，其中关于坚果及其加工食品等中含有黄曲霉毒素的通报数量排全球第五，其中有49条通报均是关于中国生产的花生。由于黄曲霉毒素的广泛性及危害性，国内对食品中黄曲霉毒素的检测不断重视，但如何提高黄曲霉毒素的检测质量依然是一个亟待解决的问题。

2 高效液色相谱法检测黄曲霉毒素

高效液色相谱法在黄曲霉毒素的检测中应用广泛。黄曲霉毒素经过衍生后，用高效液色相谱法与荧光检测相结合进行检测，检测的效果最好、灵敏度高。检测过程中，利用乙腈等作为流动相，并利用四元泵将缓冲液将溶剂注入色谱柱中，样品中的不同组分经过分离可通过检测系统检测含量。在应用高效液色相谱法检测时，首先用三氯甲烷、甲醇等溶剂对检测样本进行处理，提取出样本中的黄曲霉毒素，通过净化及衍生化后，置于反相色谱柱中，使用荧光检测器对其进行全面的检测分析。利用外标法分析系统各组分的峰高及面积，通过标准曲线即可准确定量。试验中，为了提高样本的纯度，减少各种杂质对检测结果的影响，会将高效液色相谱法与免疫亲和层析技术结合使用，从而实现对样本中黄曲霉毒素的特异性和活跃性的检测。当黄曲霉毒素进入免疫亲和柱中时，会发生免疫亲和反应，使得黄曲霉毒素被吸附在免疫亲和柱中的固体支持物上。然后向柱中加入提取融合剂，其中的抗体与黄曲霉毒素融合将其提取出来。检测结束后，使用清水就能将免疫亲和柱里的样本残留清除干净，然后再使用洗脱剂清除黄曲霉毒素残留。

为了提高黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1的检测灵敏度，可采用电化学衍生法、光化学衍生法、碘衍生法、三氟乙酸柱前衍生法等进行处理。目前，三氟乙酸柱前衍生法能实现较高的检测灵敏度。将荧光检测器与高效液色相谱法相结合，能够达到更高的灵敏度和分辨度，使得检测精确度提高，可用于不同类型的黄曲霉毒素检测分析。但由于检测流程复杂，且黄曲霉毒素种类众多、结构类似，因此在进行分离时需要消耗大量人力、物力资源，分离时间也较长。由于黄曲霉毒素B1、G1的检测灵敏度相对较低，因此在实践中，必须使用衍生化法进行处理。另外，应用高效液相色谱与质谱串联法，精确定量、定性分析食品中的黄曲霉毒素不仅高效快捷，灵敏度也大大提高，是目前发展的主要方向。

3 检测结果分析与探究

3.1 优化色谱条件

通过查阅大量的实验数据可以发现，大部分黄曲霉毒素的检测使用甲醇或乙腈和水作为流动相。由于甲醇与水的组合形成的峰形好，出峰时间比乙腈与水的要短，因此检测中常选用甲醇和水的组合作为流动相。当甲醇与水的比例在45∶55时，进行黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的分离效果最好。为了筛选出黄曲霉毒素B1的最佳检测波长，经过大量实验数据分析发现，在选择流动相作为背景溶液、使用荧光检测器对黄曲霉毒素B1标准溶液进行检测时，使用λ ex/λ em为360 nm/450 nm的波长时，杂峰与基线噪音的干扰较少[1]。

3.2 线性关系与检出限

使用上述的检测方法对黄曲霉毒素B1标准溶液进行检测时，以峰面积作为纵坐标、以B1的浓度作为横坐标，可得出如下的回归方程：y=3.288x+0.0127，相关系数为0.999 7，根据3倍信噪比得出检出限为1.02 μg/kg。

3.3 回收率和精确度

有实验显示，若取6份20 g相同大米，检测出的黄曲霉毒素B1浓度分别为 5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg、15 μg/kg、15 μg/kg，检测后回收率在82.4%～88.6%。若取40 μg/kg黄曲霉毒素B1标准液进行6次平行试验，得到峰面积分别为1 065、1 068、1 071、1 072、1 074、1 075，从而算出精确度为0.4[2]。