拉乌尔菌Raoultella sp.Pan22x菌株群体感应抑制活性的培养基及发酵条件的优化

，，， ， ，章伟

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

随着人类抗生素的滥用，耐药菌的数量越来越多，甚至出现了“超级细菌”，传统的抗生素治疗感染性疾病已难以达到预期的效果.因此，寻找新型抗菌物质、解决细菌对抗菌药物的耐药性问题已经成为了全球紧迫的研究课题.群体感应(Quorum sensing, QS)是一种通过信号分子的浓度来协同控制细菌周围环境中自身或其他细菌的数量变化的现象.当细菌种群数量增多时，胞外信号分子密度增加，达到临界值后扩散到胞内并与受体蛋白靶向结合，从而控制特殊基因的表达，群体感应可以调控细菌的生理现象，如鞭毛运动、细菌发光和生物膜等[1-5].QS主要分为3类：G-菌的酰基高丝氨酸内酯(AHL)介导的LuxI-LuxR型QS系统；G+菌的寡肽介导的QS系统；种间信号呋喃酮酰胺硼酸二酯介导的QS系统[6].QSIs是阻断细菌的QS从而抑制特殊的基因表达的物质.与传统抗生素相比群体感应抑制剂(QSIs)就是在抑制毒素分泌，影响细菌生理活动的过程中并不影响细菌的生长，因此不会引起细菌耐药性的产生[7].以干扰细菌群体感应系统为靶标开发新型的抗菌药物，为解决细菌的耐药性提供了一条新的研究思路.

Raoultellasp.Pan22x是实验室从东海北纬29.995 6度，东经122.394 2度海域海面海水，海泥，海藻样品中分离得到具有群体感应抑制活性拉乌尔菌.国内外没有报道过对拉乌尔菌具有群体感应抑制活性的研究.产生活性次级代谢产物不仅与菌种的本身特性有关，还与菌种生存环境培养基的组成及发酵转化条件息息相关.只有在合适的培养基成分和培养条件下，才能使菌种的优良性状得到充分的发挥，来提高产物产量和活性.培养基的组成成分包括碳源、氮源和无机盐等.培养条件优化包括pH、温度、接种量和培养时间等，因此，欲提高产物的产量以及活性，需要对培养基的组成和培养条件进行工艺优化.以实验室分离的拉乌尔菌Raoultellasp.Pan22x为出发菌株，通过单因素以及正交分析设计试验对菌种的培养基成分和发酵条件进行初步研究，为后续工业化生产提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

拉乌尔菌Pan22x于2014年4月从东海北纬29.995 6度，东经122.394 2度海域海面海水、海泥海藻样品中分离得到.

1.2 报告菌株来源

紫色杆菌ATCC12472和紫色杆菌CV026由美国罗德岛大学David C. Rowley教授提供.铜绿假单胞菌PAO1为实验室保存.

1.3 培养基

LB海水琼脂培养基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15～20 g/L，海盐 33 g/L.

LB海水液体培养基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，海盐33 g/L.

LB琼脂培养基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L.

LB液体培养基：酵母提取物 5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L.

1.4 发酵培养基的优化

1) 基础培养基的筛选.选择LB、ISP2、查氏、高氏一号、FP-1、PDA、陈海水LB培养基和LB为基本培养基.以5%的接种量将种子液分别接种到液体培养基中(250 mL三角瓶装液100 mL)，培养72 h.测粗提物的质量和群体感应抑制活性.

2) 碳源的筛选.分别加入10 g可溶性淀粉(A)、蔗糖(B)、葡萄糖(C)、乳糖(D)、β-环糊精(E)，麦芽糖(F)和正己烷(G)到基础培养基中，其他成分不变.其他条件同上，重复3次.

3) 氮源的筛选[8-9].分别加入牛肉浸膏(a)、大豆粉(b)、(NH4)2SO4(c)、NH4Cl(d)、尿素(e)、玉米粉(f)、鱼粉蛋白胨(g)和NH4H2PO4(h)代替LB培养基中的蛋白胨(i)，其他条件同上，平行3次.

1.5 培养条件的的优化

以优化后的培养基为发酵培养基，对菌株Raoultellasp.Pan22x初始pH值、温度、接种量、发酵时间、摇床转速及装液量发酵条件进行优化.将培养基初始pH值分别设为4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5；温度分别调为20，26，30，33，37，40 ℃；转速分别调为0，100，120，150，180，200 r/min；发酵时间分别调为24，48，72，96，120，144，168 h；在250 mL的三角瓶中，分别装入40，60，80，100，120，140，160 mL发酵培养液；接种量分别设为装液量的2%，6%，10%，14%，18%，22%；平行3次，其他发酵条件同1.4.测定粗提物质量和群体感应抑制活性.

1.6 粗提物的制备及活性物质的检测

发酵液经8 000 r/min离心10 min，取上清液加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩至干称质量，后用甲醇溶解成50 mg/mL的溶液作为提取物.半透明圈抑制的测定：20 mL融化的固体LB培养基冷却至40 ℃，加入10%过夜培养的紫色杆菌ATCC12472菌液，混匀后倒平板.待平板凝固后，用灭过菌的打孔器打孔，每个孔内加20 μL提取物.用20 μL呋喃酮(0.5 mg/mL)作为阳性对照以及20 μL甲醇作为阴性对照.培养24 h，测定半透明抑制圈的大小.重复3次.

2 结果与分析

2.1 基础培养基的选择

良好的生长环境才能使菌种生长繁殖旺盛，代谢能力强，有利于代谢产物的生成.拉乌尔菌Raoultellasp.Pan22x在8种培养基中的生长状况和产物的转化情况如图1所示.在LB培养基中粗提物的质量和半透明圈直径都达到最大值.虽然陈海水培养基发酵液活性好，但是粗提物质量低.因此选用LB培养基为发酵培养基.

图1 不同培养基对菌株Raoultella sp.Pan22x发酵的影响Fig.1 Effects of different culture media on Raoultella sp.Pan22x fermentation

2.2 碳源的种类的优化

碳源是发酵培养基的主要成分之一，为微生物提供能源.不同碳源对菌株Raoultellasp.Pan22x发酵代谢物质具有显著影响.不同质量分数的碳源对发酵产物质量和活性有着明显的影响，过少的碳源主要表现为促进作用，过多碳源反而会产生抑制作用.以淀粉为碳源的发酵粗提物质量及半透明圈直径均为最大值，粗提物质量为62.75 mg,半透明圈直径达11.67 mm；而以麦芽糖为碳源的发酵粗提物质量达到最小值为38.33 mg；正己烷为碳源的半透明圈直径最小为4.33 mm，因此选用淀粉作为培养基碳源(图2).

图2 不同碳源对菌株Raoultella sp.Pan22x发酵的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on the fermentation of Raoultella sp.Pan22x

2.3 氮源种类的优化

不同的有机氮源对Pan22x发酵产物有着显著影响，其中以蛋白胨作为氮源时，发酵液粗提物和半透明圈直径达到最高，质量为68.67 mg，半透明圈直径为10 mm；大豆粉次之.相比于无机氮源，发酵液粗提物质量和半透明圈直径都有明显的提高，因此选择蛋白胨作为最优氮源(图3).

图3 不同氮源对菌株Raoultella sp.Pan22x发酵的影响Fig.3 Effecst of different nitrogen sources on the fermentation of Raoultella sp. Pan22x

2.4 培养基组成正交实验的优化

通过上述培养基组成的单因素实验，获得最优碳源为淀粉、氮源为蛋白胨.同时可以发现培养基的成分及其含量都对菌体的生长和产物的形成有很大的影响.为进一步研究培养基的组成对菌株转化能力的影响，以淀粉、蛋白胨、酵母浸粉和氯化钠为4个因素，取他们的3个水平，设计一个正交实验[10]，以半透明圈直径为指标，再进行方差分析.因素和水平设计见表1，正交实验结果见表2，方差分析见表3.

表1正交实验设计因素水平表

Table1ThedesignoforthogonalcombinationexperimentbyL9(34) %

因素质量分数淀粉蛋白胨酵母膏氯化钠13.03.001.024.04.00.32.035.05.00.54.0

表2 正交实验结果Table 2 The result of orthogonal combination experiment

表3 正交实验结果方差分析表Table 3 Analysis of variance for orthogonal test

通过直观分析法统计分析，根据极差R的大小关系可以看出：影响产物群体感应抑制活性大小的因素主次顺序为蛋白胨>淀粉>酵母浸粉>氯化钠，最优发酵培养基成分为淀粉4%，蛋白胨4%,酵母浸粉0.3%,氯化钠1%.

3 培养条件的的优化

3.1 培养温度的优化

不同培养温度对菌株Raoultellasp.Pan22x的活菌量和发酵液活性均有较大影响，菌株Raoultellasp.Pan22x在20～40 ℃时均可生长，其中在26～37 ℃时发酵液粗提物质量较高；在发酵液活性方面，30 ℃时发酵液显示出较强的活性，其半透明圈直径可达12.67 mm，而40 ℃时发酵液活性较低(图4).

图4 不同培养温度对菌株Raoultella sp.Pan22x发酵的影响Fig.4 Effects of different incubation temperatures on the fermentation of Raoultella sp.Pan22x

3.2 初始pH的优化

培养基的初始pH值对菌体的生长至关重要，影响发酵液产物的形成.菌株Raoultellasp.Pan22x在pH 4.5～9.5时均可生长，其中在pH 6.5～7.5时发酵液粗提物质量较高，pH 4.5时菌株生长受到一定的抑制，说明弱碱条件有利于菌株生长；在发酵液活性方面，初始pH 6.5～7.5时的发酵液活性明显高于pH 4.5～5.5时的发酵液活性.在pH 7.5时发酵液粗提物质量和半透明圈活性均达到最佳值.因此，发酵培养基的初始pH值选为7.5最佳(图5).

图5 初始pH对菌株Raoultella sp.Pan22x发酵的影响Fig.5 Effects of initial pH on Fermentation of Raoultella sp.Pan22x

3.3 摇床转速的优化

摇床振荡培养可以保持培养基良好的溶氧量，还可以使菌种与培养基中营养成分充分接触，促进发酵产物的生成.Raoultellasp.Pan22x在静止和振荡都能生长.100～180 r/min中发酵粗提物质量较高，150，180 r/min时，产物活性最好，由于150 r/min质量相对高，所以选择150 r/min为最佳培养转速(图6).

图6 摇床转速对菌株Raoultella sp.Pan22x发酵的影响Fig.6 Effect of shaking speed on Raoultella sp.Pan22x fermentation

3.4 接种量的优化

在一定范围内，接种量的多少决定了菌种在培养基中生长繁殖速度的快慢.接种量在2%～22%时Raoultellasp.Pan22x发酵产物均有活性.在10%时粗提物质量和活性都达到最优.在10%以后粗提物质量和活性都有明显的下降.因此选择接种量为10%为最优接种量(图7).

图7 接种量对菌株Raoultella sp.Pan22x发酵的影响Fig.7 Effects of inoculation amount on Fermentation of sRaoultella sp.Pan22x

3.5 装液量的优化

由于含氧量和营养物质的影响，选择最佳装液量对产物质量和活性都要明显的影响.在250 mL锥形瓶中装液量为100 mL时粗提物质量和活性达到最大.当装液量达到140 mL时，活菌量有所下降，且发酵液活性也降低，说明菌株Raoultellasp.Pan22x生长对含氧量和营养物质有一定的要求.装液量过少或过多，都不利于菌株的发酵.因此，选择在250 mL锥形瓶中装液100 mL为最佳装液量(图8).

图8 装液量对菌株Pan22x发酵的影响Fig.8 Effects of liquid volume on Fermentation of strain Pan22x

3.6 培养时间的优化

发酵时间对发酵粗提物和发酵液活性有着影响，在培养12～120 h时，菌体发酵粗提物和活性维持较高的水平；在48～72 h，随着时间的延长，菌体发酵液粗提物质量和活性出现明显下降趋势；在发酵液粗提物质量和活性方面，在96 h到达最大值；综合以上结果，确定96 h为Raoultellasp.Pan22x菌株最佳发酵时间(图9).因素和水平设计见表4，正交实验结果见表5，方差分析见表6.

图9 培养时间对菌株Pan22x发酵的影响Fig.9 Effects of culture time on the fermentation of strain Pan22x

因素温度/℃pH转速/(r·min-1)接种量/%装液量/mL培养时间/h1305.5120660722336.51501080963377.518014100120

表5 正交实验结果Table 5 The result of orthogonal combination experiment

表6 正交实验结果方差分析表Table 6 Analysis of variance for orthogonal test

通过直观分析法统计分析，根据极差R的大小关系可以看出：影响产物群体感应抑制活性大小的因素主次顺序为接种量>温度>pH>转速>培养时间>装液量.最优发酵条件组合为D1A2B3C2F1E2，即:接种量10%，温度30 ℃，pH 7.5，转速 150 r/min，培养时间96 h，装液量100 mL/250 mL.

4 结 论

对培养基成分和发酵优化进行综合验证，菌种菌株Raoultellasp.Pan22x的最优培养基为LB培养基，其配方为淀粉4%,酵母浸膏0.3%,蛋白胨4%，NaCl 1%.最优发酵条件组合为30℃，pH 7.5，摇床转速150 r/min，培养时间96 h，接种量为10%，装液量为100 mL/250 mL.在优化的各因素中,蛋白胨对Raoultellasp.Pan22x菌株产群体感应抑制活性物质影响最大，并且具有负效应，即其质量分数在一定范围内量越多,群体感应抑制活性物质越多，相比于无机氮源，有更好的效果，并且粗提物质量普遍高于无机氮源的质量，Raoultellasp.Pan22x在以有机氮源作为氮源时，生长速度和代谢情况相比以无机氮源作氮源时要好.在筛选菌株用陈海水LB培养基发酵时粗提物的质量提高了4.2倍，群体感应抑制活性提高了1.4倍.在发酵条件优化中，接种量对Raoultellasp.Pan22x菌株产群体感应抑制活性物质影响最大，在10%最好，接种量过高，会导使菌体生长过旺，导致培养基中营养成分和氧气的消耗过快，造成营养和溶氧量不足，不利于产生活性物质.装液量对其影响不大，在实际生产操作中，可适当增加装液量.说明该工艺优化有一定的效果和可行性，为群体感应抑制的进一步研究提供了来源保障，并为工业化发酵Raoultellasp.Pan22x分离得到群体感应抑制剂提供了借鉴.

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